利用裂褶菌生物转化人参皂苷制备人参稀有皂苷的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用裂褶菌生物转化人参皂苷制备人参稀有皂苷的方法，采用新方法对人参皂苷进行生物转化，在发酵过程中，裂褶菌不但能降解人参皂苷生成大量稀有皂苷，同时还能产生大量的裂褶菌多糖、多肽、生物碱、酶、氨基酸、维生素等各种生物活性物质；最大限度地提高了发酵产品的保健和药用功效。对人参皂苷进行生物转化，在发酵过程中，裂褶菌不但能降解人参皂苷生成大量稀有皂苷，同时还能产生大量的裂褶菌多糖、多肽、生物碱、酶、氨基酸、维生素等各种生物活性物质；最大限度地提高了发酵产品的保健和药用功效。本发明专利技术方法既可以制备单体稀有皂苷，也可以直接提取粗提取物用于产品开发，达到简单、高效、安全绿色、低成本的加工目的，为工业化生产、食品和新药制备提供方法保证。

Preparation of rare ginsenosides from Panax ginseng by biotransformation of Panax ginseng

The invention discloses a method for using split pleat bacterium biotransformation of ginsenoside for preparing rare ginsenoside, using a new method of ginsenoside biotransformation in the fermentation process, Schizophyllum degradation can not only generate a large number of rare ginsenoside saponins, also can produce large amount of bioactive substances split pleat bacterium polysaccharide, peptides, alkaloids, enzymes, amino acids, vitamins and other; maximize the health and medicinal effect of fermentation products. The ginsenoside biotransformation in the fermentation process, Schizophyllum degradation can not only generate a large number of rare ginsenoside saponins, also can produce a large number of bioactive substances split pleat bacterium polysaccharides, peptides, alkaloids, enzymes, amino acids, vitamins and other; maximize the health and medicinal effect of fermentation products. The method can not only prepare monomeric rare saponins, but also extract crude extracts directly for product development, so as to achieve simple, efficient, safe, green and low cost processing purposes, and provide a method guarantee for industrial production, food and new drug preparation.

【技术实现步骤摘要】
利用裂褶菌生物转化人参皂苷制备人参稀有皂苷的方法
本专利技术涉及人参稀有皂苷的制备方法，公开了一种利用裂褶菌生物转化人参皂苷制备人参稀有皂苷的方法，属于食药用真菌液体发酵

技术介绍
人参皂苷为人参属药用植物人参、西洋参和三七的主要有效成分，它具有人参属植物的主要生理活性。到目前为止，分离并确定结构的人参单体皂苷已达100余种。人参皂苷按照苷元的结构不同分为二醇型人参皂苷(Rb1、Rc、Rb2、Rd、Rg3、Rh2、compoundK等)和三醇型人参皂苷(Re、Rg1、Rg2、Rf、Rh1等)，其中人参皂苷Rb1、Rc、Rb2、Rd、Re和Rg1是人参属植物的主要皂苷，在人参皂苷中约占90%。稀有人参皂苷,如人参皂苷Rg3、F2、compoundK、Rh2、Rh3等，在人参中微量存在或不存在。最新药理学研究表明,这些稀有人参皂苷具有多种生理活性，其中抗癌、抗糖尿病、抗氧化和提高免疫力等药理作用非常显著。人参皂苷的代谢研究表明，人参皂苷经口服，在消化系统酶和肠道微生物的作用下转化为人参稀有皂苷后，被吸收起到药效;1994年日本Kobashi等发现了人参皂苷Rb1和Rg1口服后,经消化系统的微生物转化为稀有人参皂苷后被人体吸收。其主要代谢机理为Rb1→Rd→F2→CK→苷元;Rg1→Rh1(或F1)→苷元。以后又相继发现原人参二醇类皂苷Rb2、Rc等口服后被肠道菌水解为F2、CK等。这些稀有人参皂苷才是真正的发挥药效的物质,但其在人参属植物中的含量很低,要获得进行药物开发必需的量几乎是不可能的。为了获得具有极高药用价值的人参稀有皂苷，从上世纪八十年代始，国内外化学及生物技术工程研究人员便开始了人参皂苷的结构改造工程，其研究目标主要锁定在对人参二醇型皂苷和三醇型皂苷C3和C20位的糖基结构修饰，利用不同方法进行人参皂苷糖基改造，使人参中含量较高的人参皂苷的糖基经过水解作用，定向转化为稀有人参皂苷。目前，用于人参皂苷糖基改造的主要方法有化学法和微生物转化法。化学法主要包括酸水解法和碱裂解法，虽然用酸、碱水解人参皂苷操作比较简单，但是存在很多缺点，如：一、酸、碱水解人参皂苷专一性差、得率低；二、在实际的工业生产中高温高压的作业环境存在着许多安全隐患；三、强酸、强碱对设备器皿的腐蚀性特别大；四、由于向环境中排放大量的污染物，严重影响了环境质量；五、化学裂解法反应太剧烈，许多皂苷元在此条件下会发生化学变化生成多种副产物，造成稀有皂苷的得率较低。与化学方法相比较而言，获得稀有人参皂苷的最佳方法就是微生物生物转化法。微生物转化人参皂苷获得稀有人参皂苷已成为当今研究的热点。微生物转化本质是利用微生物本身所产生的酶对外源底物进行的催化反应。因为某些微生物细胞可以产生一种或多种酶，把特定的化合物变成结构相关的更有经济价值的产物，来完成常规化学方法难以实现的生化反应。多年来,研究者们对人参皂苷的微生物转化途径及产物进行了细致的研究,为人参皂苷的制备提供了广泛的途径。但是这些研究所使用的微生物（细菌和霉菌）大多数是不安全的，不能用于食品和药品的生产。人的肠内菌如Bacteroidessp.,Bifidobacteriumsp.,Bifidobacteriumbifidum,Bifidobacteriumbreve,Fusobacteriumsp.,Lactobacillusdelbrueckii,andLeuconostocparamesenterioides等是安全的可以用于食品生产的微生物，许多研究展示了其水解主要人参皂苷为稀有皂苷的能力，但是这些微生物属于厌氧菌，其培养条件复杂，培养基成本较高，人参皂苷的转化率较低。一些丝状真菌如Aspergillusniger,Aspergillusoryzae,Mucorjavanicus,Penicillumroqueforti等已经广泛的应用于食品的工业化发酵生产，被认为是安全的微生物，在人参皂苷的生物转化上由于转化率较高而倍受青睐。但是最近的一些研究表明这些真菌会产生一些致病毒素，如Aspergillusniger一种最重要的生物工程菌，在工业发酵过程中会产生两种致癌的霉菌毒素：伏马菌素和赭曲霉素。因而寻找一种安全可食用的微生物用于人参皂苷的生物转化，对大规模工业化生产稀有人参皂苷具有重要的意义。食药用菌是一种重要的生物资源,其种源十分丰富，在我国被用于食品和药品已有上千年的历史。食药用菌在液体培养过程中，产生的菌丝体的营养成分与生理功效与子实体十分接近。因此其液体发酵培养技术越来越受到人们的重视，该技术比之于传统的食药用菌的栽培生产技术有明显的优越性。表现在新陈代谢旺盛、菌丝分裂迅速，在短期内便可获得大量的菌丝体和代谢产物。其发酵液中产生的代谢产物为：多糖、多肽、生物碱、萜类化合物、酚类、甾醇、酶、核酸、氨基酸、维生素等各种化合物，这些物质具有抗炎、抗菌、抗癌、抗衰老、抗溃疡、提高免疫力及防辐射等医疗保健功效。食药用菌的营养和药用价值对人类的健康是有益的、安全的，但直到目前为止没有使用食药用菌高效生物转化人参皂苷的报道。
技术实现思路
本专利技术公开一种利用裂褶菌生物转化人参皂苷制备人参稀有皂苷的方法，可以实现使用绿色、高效、安全和可食用的食药用菌生物转化人参皂苷，制备药用价值更高的稀有人参皂苷。克服了过去使用不安全的，不能用于食品和药品生产的细菌和霉菌作为发酵菌种的缺点。本专利技术的技术解决方案包括以下步骤：1)以裂褶菌为发酵菌种，按5%-30%的接种量接种到液体发酵培养基中，培养基pH为2-9，人参皂苷的投料量为1-60g/L，摇床转数为10-300r/min，在15-40℃条件下发酵培养2-10天。2)发酵结束后，过滤菌液，菌丝用80%乙醇超声提取3-5次，每次30min。提取液在40-60℃下减压回收溶剂，浓缩为水溶液。3)将浓缩的提取液与菌液合并，用大孔树脂D101进行分离，20%-90%乙醇梯度洗脱，采用薄层色谱法检测，收集、合并与人参稀有皂苷阳性对照品Rf值相同的流份溶液，减压回收溶剂。4）使用制备型液相色谱分离制备，得到稀有人参皂苷F2、compoundK、compoundO、compoundY、compoundMc1、compoundMc、C-Mx1和C-Mx。所述的一种利用裂褶菌生物转化人参皂苷制备人参稀有皂苷的方法步骤（1）优选：液体发酵的接种量为8%-10%，发酵培养基的pH为5-6，人参皂苷的投料量为10-20g/L。所述的一种利用裂褶菌生物转化人参皂苷制备人参稀有皂苷的方法步骤（1）优选：液体发酵的摇床转数为150-180r/min，发酵温度为25-28℃，发酵时间为5-6天。所述的一种利用裂褶菌生物转化人参皂苷制备人参稀有皂苷的方法步骤（1）优选：生物转化培养基中的营养采用碳源和氮源，其中碳源可为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉、糊精、饴糖；氮源可为酵母粉、蛋白胨、牛肉膏、玉米粉、花生粉、黄豆粉、鱼粉；此外还需要添加一定比例的无机盐、生长因子、维生素，所述的无机盐为NH4Cl、KH2PO4、MgSO4·7H2O、NH4NO3、K2HPO4、KCL、(NH4)2SO4、FeSO4·7H2O或CaCO3生长因子为生物素、维生素为维生素B1或维生素C；本本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用裂褶菌生物转化人参皂苷制备人参稀有皂苷的方法，包括以下步骤：1）以裂褶菌为发酵菌种，按5%‑30%的接种量接种到液体发酵培养基中，培养基pH 为2‑9，人参皂苷的投料量为1‑60g/L，摇床转数为10‑300r/min，在15‑40℃条件下发酵培养2‑10天；2）发酵结束后，过滤菌液，菌丝用80%乙醇超声提取3‑5次，每次30min；提取液在40‑60℃下减压回收溶剂，浓缩为水溶液；3）将浓缩的提取液与菌液合并，用大孔树脂D101进行分离，20%‑90%乙醇梯度洗脱，采用薄层色谱法检测，收集、合并与人参稀有皂苷阳性对照品Rf值相同的流份溶液，减压回收溶剂；4）使用制备型液相色谱分离制备，得到人参皂苷F2、compound K、compound O、compound Y、compound Mc1、compound Mc、C‑Mx1和C‑Mx。

【技术特征摘要】
1.一种利用裂褶菌生物转化人参皂苷制备人参稀有皂苷的方法，包括以下步骤：1）以裂褶菌为发酵菌种，按5%-30%的接种量接种到液体发酵培养基中，培养基pH为2-9，人参皂苷的投料量为1-60g/L，摇床转数为10-300r/min，在15-40℃条件下发酵培养2-10天；2）发酵结束后，过滤菌液，菌丝用80%乙醇超声提取3-5次，每次30min；提取液在40-60℃下减压回收溶剂，浓缩为水溶液；3）将浓缩的提取液与菌液合并，用大孔树脂D101进行分离，20%-90%乙醇梯度洗脱，采用薄层色谱法检测，收集、合并与人参稀有皂苷阳性对照品Rf值相同的流份溶液，减压回收溶剂；4）使用制备型液相色谱分离制备，得到人参皂苷F2、compoundK、compoundO、compoundY、compoundMc1、compou...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘志，李玉，孙光芝，阮长春，王立娟，
申请(专利权)人：吉林农业大学，
类型：发明
国别省市：吉林,22