本发明专利技术涉及一种单克隆抗体及用途，尤其是针对志贺毒素Ⅱ型（Ｓｈｉｇａ ｔｏｘｉｎ Ⅱ，ＳｔｘⅡ）的单克隆抗体及用途，属于生物制药技术领域。本发明专利技术从能够分泌抗ＳｔｘⅡ单克隆抗体的杂交瘤细胞株Ｓ２Ｃ４中，通过ＰＣＲ法克隆获得该抗体重链和轻链可变区基因，并通过基因工程的方法将两个基因重组后表达出能特异性识别ＳｔｘⅡ蛋白的ＳｃＦｖ抗体活性片段，可制备用于抗ＥＨＥＣ感染及并发症的药物。其优点是：单克隆抗体Ｓ２Ｃ４不仅对ＳｔｘⅡ原毒素具有坚强的中和活性，还对ＳｔｘⅡ多个变种具有坚强的中和活性。实验证明：单克隆抗体Ｓ２Ｃ４的中和谱广，可保护小鼠抵御致死量ＳｔｘⅡ毒素及其亚型的攻击，是一株极具应用前景的药物候选分子。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种单克隆抗体及用途，尤其是志贺毒素II型A亚基 的单克隆抗体及用途，属于生物制药
技术介绍
肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic f"力er/c力/s co//., EHEC)感染是一种重要传染病，在世界各地都有不同规模的暴发流行， 已成为全球性的公共卫生问题。EHEC血清型众多，包括0157， 026， 091， 0103和0111等，而其中以0157型引起的暴发为最多。我国江 苏、安徽、河南三省部分地区于1999-2000年暴发了 EHEC 0157: H7 感染性腹泻病并发急性肾衰，造成了重大的人员和财产损失。美国 2006年9-10月份也发生了由于食用污染的菠菜而导致E服C 0157: H7 感染事件，波及26个州，多人引发溶血性尿毒综合征(Hemolytic Uremic Syndrome, HUS),并导致死亡，引起世界广泛关注。EHEC感 染可使人患腹泻(Diarrhoea )、出血性结肠炎(Hemorrhagic Colitis, HC),还可引发HUS、血栓性血小板减少性紫癜(Thromboric Thromobocytopenic Porpura， TTP)等严重并发症，严重者可导致死 亡，致死率达5%~10%。对于EHEC感染，目前临床上尚缺乏有效的治 疗和预防措施，特别是使用抗生素或止泻药可导致EHEC释放致死性 志贺毒素(Shiga Toxin, Stx)，从而使患者并发肌S的危险性增加。 而对于发生HUS的病人，其住院病死率可高达87%。研究表明，EHEC感染的主要致病机理可分为两个方面， 一是由 菌体基因组毒力岛LEE (Locus of Enterocyte Effacement, LEE) 编码的多种致病因子所介导的粘附^末平才几制(Attaching and Effacing, A/E),通过A/E机制，细菌可破坏肠上皮细胞，粘附并定居于肠道；二是分泌毒素，EHEC能产生如志贺毒素(Stx)、溶血素 (Hly)等多种细胞外毒素，其中以Stx的致病性为最。Stx可以穿越 肠上皮细胞进入血液循环，与其受体-丙糖酰基鞘氨醇(Gb3)结合， 造成肠道、中枢神经系统等器官的损伤，特别是Gb3受体含量高的肾 脏，受损后易引发HUS;同时Stx还可以促进EHEC在肠上皮细胞的吸 附和定居，进一步加重病情。目前针对HUS的免疫治疗主要有以下两种口服人工合成的多糖 衍生物作为Stx毒素受体Gb3的类似物在肠道内中和毒素，从而减少 毒素在血液中的浓度。但是糖与蛋白质之间结合亲和力较低；由于病 人的呕吐、肠梗阻等降低了多糖药物在肠道内的有效浓度；另外，对 于已经进入血液循环的毒素分子和已发生HUS的病人再从胃肠道给 药在时间上也为时过晚。第二，由Stx毒素中和抗体所介导的免疫治 疗方案已在动物感染模型或临床前期试验中显示良好的应用前景。 Stx毒素的中和单抗能以高特异性和高亲和力与毒素分子结合，封闭 Stx分子中与其受体结合的表位，从而阻断HUS发生的可能性。目前 世界范围内有数个研究小组(如美国Tufts大学和日本Teijin公司 等)都在开展Stx中和单抗的研究工作，其中有多个抗体候选分子无 论在体外毒素中和试验还是体内HUS的治疗均取得良好效果。在我 国，疫情主要集中在经济不发达的农村地区，患者主要是农民，且目 前已处于高发流行期，疫情不可能短期消失，而目前尚缺乏该方面的 相关储备。据申请人了解， 一篇申请号为200610054048.6，申请曰 为2006年1月20日，名称为"抗EHEC0157志贺样毒素IIA亚单位 单克隆抗体5F3轻、重链可变区基因及应用，，的中国专利技术专利申请公 开了 EHEC 0157志贺样毒素II毒素亚单位Stx2A单克隆抗体5F3重链 和轻链可变区基因和其编码的多肽，以及所述基因和多肽在制备用于 诊断和治疗EHEC 0157感染及其并发症方面药物中的应用，虽然同样是对EHEC 0157感染及其并发症提供了治疗方案，但是由于Stx毒素 分为Stxl和StxII两个亚型，其中StxII又有c、 d、 e、 f等多个变 种。StxII较Stxl更易引起HUS，而StxII中又以StxII原毒素和 StxIIc、 StxIIvha等变种的毒力最强，而该申请所提供的单克隆抗 体只针对StxII原毒素，对StxII变种没有作用，无法^氐御由StxII 变种引起的EHEC0157感染，且Stx在人体内分泌量很低，不足以刺 激机体产生足量的抗体抵御再次感染，因此，阻断StxII毒素及其变 种与其受体Gb3结合、防止HUS的发生已成为攻克E服C感染所急需 突破的瓶颈。
技术实现思路
本专利技术针对以上现有技术存在的缺点，提供抗志贺毒素II型A 亚基的单克隆抗体S2C4重链和轻链可变区基因及其所编码的多肽， 其重组后可以表达出特异性识别和结合StxII及其变种的抗体活性 片段，并可制备用于EHEC 0157:H7感染及其并发症的药物，为临床 治疗EHEC 0157感染提供新的途径。为了解决以上技术问题，专利技术人从能够分泌抗志贺毒素II型单克 隆抗体的杂交瘤细胞林(命名为S2C4)中，通过PCR法克隆获得单克 隆抗体重链和轻链可变区基因。其主要步骤是从杂交瘤细胞抹S2C4 中提取总RNA，以0ligo(dT)2。为引物，逆转录成cDNA,然后利用特 异性引物分别扩增S2C4的重、轻链可变区基因，经过序列测定和利 用NCBI中BLSAT服务器进行比对，确认S2C4重链可变区基因序列是 序列表中SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列，其编码的多肽是序列表中 SEQ ID NO. 3所示的氨基酸序列；轻链可变区基因序列^列表中SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列，其编码的多肽是序列表SEQ ID NO. 4所 示的氨基酸序列。上述两个基因经重组后可表达出特异性识别志贺毒 素II型蛋白的ScFv抗体活性片段。对于单克隆抗体S2C4重、轻链可变区基因，通过应用NCBI中BLAST专业数据库进行同源性比较，结 果表明所获得的基因序列的确来自小鼠胚系基因，和现有报道的各 种抗体基因序列不一致；且所获得的重、轻链可变区基因可以编码正 确的'J 、鼠抗体可变区氨基酸序列。本专利技术的单克隆抗体S2C4重链和轻链可变区基因可以采用基因 工程方法，构建和表达多种形式的小分子基因工程抗体，如ScFv， Fab,嵌合抗体等，制备用于抗EHEC感染及并发症的药物。本专利技术所制备的鼠源单克隆抗体S2C4的靶分子为Stx II分子的A 亚基。S2C4不仅对StxII原毒素具有坚强的中和活性，还对StxII变 种具有坚强的中和活性。实验证明单克隆抗体S2C4的中和谱广， 可保护小鼠抵御致死量StxII毒素及其亚型的攻击，是一抹极具应用 前景的药物候选分子。 附图说明图1为S2C4重链和轻链可变区基因及其单链抗体基因的PCR产物， 图中1. Marker, 2. ScFv, 3. VH， 4. VI。图2为SDS-PAGE检测纯化的S2C4单链抗体ScFv，图中1.蛋白标记物， 2.S2C4单链抗体ScFv,相对分子量(xl03)。图3为Western-blot检本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种单克隆抗体重链可变区基因，其碱基序列如序列表中ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：焦永军，郭喜玲，崔仑标，曾晓燕，吴涛，史智扬，
申请(专利权)人：江苏省疾病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]
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