复合固定化酶的制备方法技术

本发明专利技术是一种制备复合固定化酶的方法，包括如下步骤：（１）制备共轭固定化酶：将通过处理已附着于多孔载体上具有侧胺基的聚胺化合物与胺反应性物料——一种双功能化合物，如戊二醛中的一个胺反应性基团相反应，它的另一个胺反应性基团与酶或酶类的自由胺基反应，并与其相联接构成共轭固定化酶。（２）将共轭固定化酶与产生该酶的微生物细胞共同包埋于一种或一种以上包埋剂中，构成复合固定化酶。（*该技术在2010年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术提出并详加阐明“复合固定化酶”(Complex Immobi-lized Enzymes)的制备方法，属生物工程领域。在医药、食品和工业上用途日益广泛的酶，其本质属于蛋白质，通常是水溶性的，且一般是不稳定的。由于酶在溶液中应用只能是一次性的，在工业生产中引起种种不便。于是专利技术了固定化酶的种种方法。各种酶类的固定化方法以及生产酶类的微生物细胞的固定化方法在文献中已有大量记载。现将有关的背景材料特别是涉及葡萄糖异构酶方面的有关背景材料作一概述。1965年，Tsumura(津村)、Takasaki(高崎)等分别发现了适合工业生产的葡萄糖异构酶生产菌种-暗色产色链霉菌(Strepto-myces phaeochromogenes)和白色链霉菌(Streptomyces albus)。1966年日本参松公司生产出酶法异构糖浆。1974年固定化葡萄糖异构酶工业化成功，推动固定化生物催化剂研究发展。我国1970年以来对玫瑰红链霉菌336、高温放线菌M1033、游动放线菌等生产葡萄糖异构酶的菌种、发酵、固定化工艺均作了研究。1988年全国固定化生物催化剂学术讨论会论文概括了固定化酶等各方面的进展。本专利技术提供一种制备复合固定化酶的方法，它包括如下内容(1)制备共轭固定化酶，其步骤如下(a)多孔载体与具有侧胺基聚胺化合物溶液接触，使聚胺附着于多孔载体上;(b)用无离子水洗涤，排除出溶剂和分散其中并未附着的聚胺，然后用已处理的多孔载体与胺反应性物料接触，该溶液是一种多功能醛、一种多功能有机卤化物、一种多功能酸酐、或是一种多功能偶氮化合物，使其中一个胺反应性基团与侧胺基起反应，留下另一胺反应性基团可以进行进一步反应;(c)用无离子水洗涤，排除出溶剂和任何溶于其中而又未反应的胺反应性物料。已处理的多孔载体与至少一种酶溶液接触，以引起酶的胺基与未反应的胺反应性基团反应，通过共价键的形式固定酶。本专利技术中多孔载体包括(1)颗粒硅藻土(Granular diatomaceous earth)，(2)空心微珠(Cenosphere)，(3)甲壳质(Chitin)。颗粒硅藻土的物理化学性质如下物理性质颗粒大小120-180目密度575公斤/立方米形状球形挤压强度17.6-18.6公斤/平方厘米颜色白至浅褐平均表面积40平方米/克平均孔体积0.16毫升/克平均孔径10-40微米化学成分(%)及性质SiO290.0AL2O36.5Fe2O32.3CaO0.2MgO0.3其它氧化物0.3含水量少于1.0溶液pH6.5-7.0结构主要是无定形硅藻土。这种多孔颗粒硅藻土由于化学上稳定，物理上刚性和价格低廉，因而它可以做为一种多孔性无机载体。空心微珠的理化性质如下1、外观园球形2、粒度粒径为1～300微米3、容重250～400公斤/立方米4、比重0.5～0.75克/立方厘米化学成分(%)SiO251.32～65.98Al2O322.62～39.86Fe2O32.18～8.73CaO 0.49～3.35MgO 0.86～1.96本专利技术中适用的聚胺包括聚乙稀二胺、聚乙烯亚胺、聚亚甲基二胺、聚六亚甲基二胺、聚四亚乙基五胺、多乙烯多胺。经聚胺处理的多孔载体，接着用胺反应性物料处理。胺反应性物料是戊二醛、甲苯-2，4-二异硫氰酸盐、重氮基联苯胺。胺反应性物料的浓度为每升溶液含1-10克。水溶性胺反应性物料和非水溶性胺反应性物料分别溶于水及有机溶剂再应用于多孔载体。有机溶剂包括甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丙酮、甲醚、乙醚、丙醚、异丙醚。反应一定时间，以使胺反应性物料从聚胺衍生游离胺基，已处理的多孔载体，用无离子水洗涤几次。应用本专利技术，先用无离子水洗涤多孔载体直至干净，然后真空排气。将聚胺溶液，配制成一定浓度，如用多乙烯多胺加到已洗涤的多孔载体上，多孔载体与多乙烯多胺水溶液体积比值约为1∶5，多乙烯多胺水溶液浓度约为0.1%-0.5%，在20-30℃轻度搅动下，有效反应时间2-5小时，过量的多乙烯多胺溶液用水洗涤已处理过的多孔载体来排除。若用戊二醛作交联剂，它的容积与多乙烯多胺溶液近似，即多孔载体与戊二醛溶液容积比值1∶5，戊二醛浓度为0.1%～1.0%，尤以0.25-0.7%浓度为宜。采用含0.05克分子碳酸氢钠的戊二醛水溶液，要求pH值为7.9-8.3。交联反应在20-30℃轻轻搅动，反应时间2小时，即得到多孔载体、多乙烯多胺和戊二醛支持物。将此生物催化剂支持物与特定的酶溶液接触，在适宜于该酶的pH下，温度20-30℃条件下轻轻搅拌4小时，即得到共轭固定化酶，于4℃保存适宜缓冲液中，备用。实施本专利技术需将上述得到的共轭固定化酶与产生该酶(或酶类)的微生物细胞共同包埋于一种或一种以上包埋剂中，构成复合固定化酶。实施本专利技术的例1详细地叙述了制备复合固定化葡萄糖异构酶的方法。用嗜酸链霉菌(Streptomyces acidophilus)发酵生产葡萄糖异构酶，依据发酵周期长短等具体条件的变化其胞内酶与胞外酶比例呈规律性变化。一般随着发酵周期延长，胞内酶与胞外酶的比值逐步递减。为使菌丝体内的葡萄糖异构酶与释放到发酵液中的葡萄糖异构酶均能充分回收，遂设计本专利技术中关于将嗜酸链霉菌细胞及所产生葡萄糖异构酶的复合固定化方法。通过实施例1，复合固定化酶这一概念变得更清晰和更明确。需要明确指出的是复合固定化酶并不局限于仅仅固定一种酶及产生该酶的微生物细胞，一种以上的酶类及产生各该酶类的一种以上的微生物细胞的复合固定化亦属于这一范围之内。各种酶类的固定化方法以及产生酶类的各种微生物细胞的固定化方法在文献中已有大量记载，通过如上所列出的关于葡萄糖异构酶研究及生产中所采用的各类菌种、发酵工艺以及与其相关联的各种固定化方法，可以清晰地看出菌种、发酵、固定化工艺等在这一具体领域的发展轨迹。关于产生酶类微生物细胞的固定化方法很多，其中以包埋法最为常用。所采用的包埋剂有卡拉胶、黄原胶、明胶、琼脂、二醋酸纤维、三醋酸纤维。实施本专利技术的第一步是将发酵生产中游离酶固定于多孔载体制备成共轭固定化酶。第二步是将载有共轭固定化酶的多孔载体与产生该酶(或酶类)的微生物细胞共同包埋于各种包埋剂中，这种包埋剂可以是单一的也可以是几种包埋剂混合使用。例1、多孔颗粒硅藻土用于固定化之前需作如下处理将40克120～180目多孔颗粒硅藻土分别用1N HCl、1N NaOH处理，每次处理后均用无离子水充分洗涤，待硅藻土沉淀后轻轻将洗涤水倾出，然后将硅藻土真空干燥。按下述工艺方法由嗜酸链霉菌发酵液制备复合固定化葡萄糖异构酶1、制备共轭固定化葡萄糖异构酶(1)将已洗涤并真空干燥的颗粒硅藻土40克与pH9.8的0.2%多乙烯多胺水溶液250毫升充分混合，置500毫升摇瓶中于28～30℃轻轻振荡搅动4小时，然后自然沉降，轻轻倾出上清液。(2)用无离子水充分洗涤以排除未附着于硅藻土上的聚胺-多乙烯多胺。然后用胺反应性物料戊二醛与附着在硅藻土上的聚胺的侧胺基结合将含0.05克分子碳酸氢钠的0.5%戊二醛溶液250毫升，pH8.2，与已附着聚胺的硅藻土置500毫升摇瓶中，轻轻振荡2小时，然后轻轻倾出戊二醛溶液，用无离子水充分洗涤，除去未反应的戊二醛，(3)将葡萄糖异构酶酶活达20，000本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备复合固定化酶的方法，它包括如下内容：（１）制备共轭固定化酶，其步骤如下：（ａ）多孔载体与具有侧胺基聚胺化合物溶液接触，使聚胺附着于多孔载体上；（ｂ）用无离子水洗涤，排除出溶剂和分散其中并未附着的聚胺，然后用已处理的多孔载 体与胺反应性物料接触，该溶液是一种多功能醛、一种多功能有机卤化物、一种多功能酸酐、或是一种多功能偶氮化合物，使其中一个胺反应性基团与侧胺基起反应，留下另一胺反应性基团可以进行进一步反应；（ｃ）用无离子水洗涤，排除出溶剂和任何溶于其中而又 未反应的胺反应性物料。已处理的多孔载体与至少一种酶溶液接触，以引起酶的胺基与未反应的胺反应性基团反应，通过共价键的形式固定酶。（２）将共轭固定化酶与产生该酶的微生物细胞共同包埋于一种或一种以上包埋剂中，制成复合固定化酶。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：张绍镇，陆维新，王忠秋，靳庆生，王晓东，
申请(专利权)人：河北师范学院，河北省科学院生物研究所，
类型：发明
国别省市：13[中国|河北]