多核苷酸结核病疫苗制造技术

编码结核分支杆菌（Ｍ．ｔｂ蛋白）的基因被克隆进真核表面载体中，以使其在哺乳肌肉细胞体内表达所编码的蛋白。动物免疫是通过注射这些称为多核苷酸疫苗或ＰＮＶ的这些ＤＮＡ构建体到动物的肌肉中而进行的。产生抗Ｍ．ｔｂ抗原的免疫抗血清。在接种小鼠的脾细胞中检测到特异的Ｔ－细胞应答，抗原应答细胞因子分泌的类型提示有Ｔ↓［ｈ］ｌ型辅助Ｔ－细胞应答的出现（即高ＩＬ－２和ＩＦＮ－γ）。Ｍ．ｔｂＤＮＡ疫苗的保护效用在牛分支杆菌ＢＣＧ攻击后的小鼠中得到证明，如测定Ｍ．ｔｂＤＮＡ接种鼠的脾和肺中分支杆菌相对于对照ＤＮＡ接种小鼠或天然小鼠中的初次感染增殖的降低。（*该技术在2015年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

技术介绍
抗病毒和细菌疫苗开发的主要障碍是不同分离体和株中外部蛋白的多样性，尤其抗多种血清型或高突变率的种类，需要诱发中和作用抗体和/或保护性细胞介导的免疫反应。由于小鼠和人细胞毒性T-淋巴细胞(CTLs)，能识别来自内部保守的病毒蛋白的表位，许多努力方向是能提供抗不同病毒株的异源性保护的CTL疫苗的开发。众所周知，当T细胞受体识别和MHC I类和/或II类分子相连的外来肽时，CTLs杀死病毒或细菌感染的细胞。这些肽可能衍生自内源合成的外来蛋白，而不论蛋白在病原体中的定位和功能。通过识别保守性蛋白的表位，CTLs可能提供异源性保护。在细胞内细菌存在的情况下，从细菌分泌或释放的蛋白被MHC I类和II类分子加工和呈递，因而产生了在降低或消除感染中起作用的T细胞应答。大多数产生CTL应答的努力在于使用复制载体，以在细胞中产生蛋白抗原，或者它们集中于把肽导入细胞溶质中。这二种途径的局限性可能降低了它们作为疫苗的可应用性。反转录病毒在维持重组病毒复制能力的情况下对作为融合蛋白表达的多肽的大小和结构具有限制，载体如牛痘作下一步的免疫作用的有效性能被抗牛痘的免疫应答所缓和。另外，病毒载体和修饰的病原体有内在的风险，能妨碍其在人类中应用。因此，被呈递的肽段表位的选择依赖于个体MHC抗原的结构，所以肽疫苗由于远亲群体中MHC单倍型的多样性具有限的效用性。Benvenisty，N.和Reshef.L表明腹膜内(i.p.)，静脉内(i.v.)或肌肉内(i.m.)导入小鼠的氯化钙沉淀的DNA能表达。DNA表达载体在鼠中肌肉内(i.m.)注射的结果说明DNA被肌肉细胞吸收，表达由DNA编码的蛋白。表明质粒以附加体的方式被维持，没有复制。后来在大鼠、鱼和灵长目骨骼肌和大鼠心肌的i.m.注射后观察到持续的表达。用核苷酸作治疗剂的技术在WO90/11092(1990年10月4日)报道，其中用裸多核苷酸接种脊椎动物。最近，在活化CTLs消除肿瘤中抗原呈递细胞表面表位的B7和主要组织相容性复合物(MHC)呈递的协同作用做了综述。一旦抗原呈递细胞(APC)表面的MHC分子呈递表位给T细胞受体(TCR)，在相同APC表面表达的B7起第二信号的作用与CTLA-4或CD28结合。其结果是CD4+辅助细胞的快速分裂，其传递信号给CD8+T细胞，使其增殖和杀死APC。对方法的成功来说，肌肉内免疫并非必要。因此，Tang等发现包被编码牛生长激素(BGH)的DNA的金微粒导入小鼠皮肤，结果小鼠产生了抗BGH的抗体。弗斯等表明喷射(jet)注射器可用于转染活动物的皮肤、肌肉、脂肪和乳腺组织。最近综述了导入核苷酸的不同方法。也可见Robinson等，其中主张鸟类流感DNA im，ip和iv对鸡给药，以提供保护抗致死攻击。小鼠中DNA阳离子脂质体复合物的静脉注射由Zhu等证明，结果是克隆的转基因系统地表达。最近，Ulmer等报道注射编码流感病毒蛋白的DNA可异源性地保护抗流感病毒感染。Wang报道用克隆的基因组(未剪切)的HIV基因肌肉内接种，能诱发小鼠抗HIV的免疫应答。不过，所获的免疫应答水平非常低，该系统使用小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)长末端重复(LTR)启动子部分和猴病毒40(SV40)启动子和终止子部分。已知SV40能转化细胞，可通过整合进宿主细胞DNA而起作用。因而，Wang等所描述的系统，施用于人是完全不合适的，这是本专利技术的目的之一。WO93/17706描述了一种接种动物抗病毒的方法，其中载体颗粒用基因构建体包被，包被的颗粒加速进入动物细胞。由Wolff等(同上)的研究最先证明编码报告基因的质粒DNA肌肉注射，结果是在注射位点和其附近的肌细胞内该基因的表达。最近报道表明编码流感A血凝素(Montgomery D.L等，1993，细胞生物学，12，pp777-783)，或核蛋白(Montgomery D.L等，同上；Ulmer，J.B.等，1993，科学，259，pp.1745-1749)的质粒注射，成功地免疫小鼠抗流感。对疱疹病毒DNA免疫作用的首次应用已有报道(Cox等，1993，病毒学杂志，67，pp.5664-5667)。编码牛疱疹病毒(BHV-1)糖蛋白g IV的质粒注射在小鼠和小牛中产生了抗g IV的抗体。用BHV-1鼻内攻击表明免疫小牛减轻症状，排出基本上比对照少的病毒。结核病(TB)是由病原体结核分支杆菌引起的肺慢性感染病。TB是世界范围临床上最显著的感染病之一，伴随而来的是每年300万人死亡和1千万新病例。估计多达世界人口的三分之一会被感染，在发展中国家，已报道5千5百万发病的TB病例。直到本世纪初，TB是美国主要死因。可是，随着卫生条件的改善和抗微生物药物的出现，死亡率稳定下降至预计到2000年该病将被根除的程度。不过，在大多数发达国家，自1980年代中期以来发病的TB病例数每年上升。该复发部分归因于迁移和免疫后损害的，HIV感染个体数目增加。假如趋势没有减弱，预计TB将在下一个十年要了三千万以上人的性命。象这些数学显得使人惊恐一样，甚至更为关注的是结核分支杆菌的多药抗性(MDR)株的出现。这些MDR株不被传统药物疗法所驯服，特别在城市中心引起最近几次TB的爆发。所以，长期TB控制的关键组分之一将是有效的疫苗。结核分支杆菌是感染巨噬细胞的细胞内病原菌，能在该类型细胞吞噬溶酶体的恶劣环境中存活。大多数吸入的杆菌被活化的小泡巨噬细胞破坏。可是，存活的杆菌能在巨噬细胞中增殖，靠细胞死亡而释放，发出了淋巴细胞、单核细胞和巨噬细胞向该点浸润的信号。负载有杆菌的巨噬细胞的裂解由迟发型超敏反应所介导，导致环绕感染细胞区域的紧密干酪样结核结节的出现。继续的DTH引起结节液化，因而释放所捕获的杆菌。大剂量的胞外杆菌进一步激发DTH，引起对支气管的损害和由淋巴的、血原性的以及支气管通路散播，最终使感染性的杆菌由呼吸扩散。对TB的免疫性涉及效应细胞的几种类型。由细胞因子比如γ-干扰素对巨噬细胞的活化是把细胞内分支杆菌增殖降到最低的一种有效方法。不过，靠这种方法常未取得完全根除分支杆菌。抗TB的保护的获得需要T淋巴细胞。在这些之中，CD8+和CD4+T细胞似乎是重要的。这些细胞类型在对分支杆菌应答中分泌γ-干扰素，显示有Th1免疫应答，和具有对分支杆菌脉冲的靶细胞的细胞毒活性。最近用β-2微球蛋白和CD8缺陷的小鼠研究中，表明CTL应答在提供抗结核分支杆菌的保护中是关键的。相反，B淋巴细胞似乎没有涉及，抗分支杆菌的抗体的被动输入不提供保护。所以，抗TB的有效疫苗必须产生细胞介导的免疫应答。T细胞抗原刺激需要MHC分子的呈递作用。为了使分支杆菌抗原可进入抗原呈递通路，它们必须从细菌中释放。在感染的巨噬细胞中，这可能与分泌或细菌裂解完成。分支杆菌具有许多潜在的T细胞抗原，有几种现已确认。这些抗原的一些由细菌分泌。一般认为抗TB的免疫性由直接针对这些所分泌抗原的CD8+和CD4+T细胞所介导。在TB的小鼠和豚鼠模型中，由降低体重减轻所测定的对细菌攻击的保护作用，已应用分泌的分支杆菌抗原的混合物获得。。几种潜在的保护性T细胞抗原已在结核分支杆菌中确认，一些作疫苗的靶物正在研究。最近工作显示主要的T细胞抗原是它们停留在巨噬细胞中的过程中，由分支杆本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种在导入脊椎动物组织中诱导一种或多种抗分支杆菌免疫应答的多核苷酸，其免疫应答选自抗体、ＣＴＬ、辅助Ｔ淋巴细胞应答和保护性免疫应答，其中所述的多核苷酸包括编码一种或多种分支杆菌蛋白或其功能性等价体的一个或多个基因，所述的基因可操作地连在转录启动子上。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：MA刘，D蒙特戈马利，J厄尔默，J康坦特，K休根，
申请(专利权)人：麦克公司，英诺吉尼蒂克斯有限公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]