从蛇毒中纯化凝血酶样蛋白酶制造技术

本文描述了一种用于蛇毒中纯化凝血酶样蛋白酶的方法，该方法包括通过三步层析从混合物中分离出所说的蛋白酶。（*该技术在2017年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种用于从蛇毒中纯化凝血酶样蛋白酶的方法。上述蛋白酶的例子有batroxobin,crotalase，并且更具体地讲为das Ancrod。后者为一种从Agkistrodon rhodostoma蛇的毒液中分离出来的抗凝剂(Merck索引1989,No.664)。已经描述了多种用于从蛇毒中制备das Ancrod的方法(英国专利1,094,301、英国专利1,177,506、英国专利1,293,793、美国专利3,743,722、美国专利3,879,369、德国公开说明书2,428,955和德国公开说明书2,734,427)。上述方法基本上以层析步骤为基础并且生成了不同收率和纯度的das Ancrod。迄今为止，从蛇毒中制备高纯度的das Ancrod仍未获得成功。人们总是分离出以das Ancrod作为主要组分的酶的混合物，而其中取决于制备过程，所说的产物总是或多或少地受到异种蛋白的污染。现在已经发现了一种从蛇毒中制备高纯度的凝血酶样蛋白酶的方法。本专利技术涉及一种用于从蛇毒中纯化凝血酶样蛋白酶的方法，该方法包括a．通过亲和层析或者在碱性离子交换剂上进行层析使蛋白酶的粗产物进行预纯化，b．使含有如上获得的凝血酶样蛋白酶的组分在弱阳离子交换剂上进行层析或者在碱性范围内通过在玻璃上吸附来分离上述组分，以及c．使来自步骤2的主要组分进行凝胶层析或者在酸性范围内通过在玻璃上进行层析来纯化该组分，但是其中步骤2和3中的至少一步包括通过在玻璃上吸附或层析而进行的分离。本专利技术还涉及来自蛇毒的纯度为95至100％的凝血酶样蛋白酶。值得推荐的是步骤b通过在玻璃上吸附来加以纯化，而步骤c则借助于凝胶层析加以纯化。在本专利技术的一个特别优选的实例中，在步骤b和步骤c中的纯化都是通过在玻璃上进行吸附或层析来实现的。精胺-、精氨酸-或肝素-Sepharose特别适于通过亲和层析进行的预纯化。适于预纯化的碱性离子交换剂具体有DEAE纤维素和DEAE-Sepharose。可以提及的用于离子交换层析的缓冲液具体为tris-磷酸盐和磷酸钠缓冲液。离子交换层析在pH5-9、优选6-8.5时进行。在预纯化的过程中，大约有70-80％的异种蛋白和其它的成分从粗酶中被除去。如果纯化的第二步采用阳离子交换剂来实现的话，那么随之应考虑以下弱酸性交换剂CM-SEPHAROSE,pH5-9，和AMBERLITE CG50,pH5-9。在玻璃上进行层析是指在pH为7.5-9.0、其中优选8.0-8.5时将das Ancrod和性质近似的凝血酶样酶以及强碱性的蛋白酶结合到玻璃基质上。用平衡缓冲液(优选tris-磷酸盐或磷酸钠缓冲液)从柱中洗下大约60％的呈未结合形式的酸性极强的异种蛋白。通过加入氯化钠将缓冲液的离子强度增加到0.3-1.0M，从而从玻璃中分级洗脱出纯度大于90％的das Ancrod。在第二步纯化步骤中，把所说的酶浓缩到大约90％。对于作为纯化步骤c的凝胶层析而言，合适的凝胶具体为SEPHACRYLS-100HR、SUPERDEX、SEPHADEX、ULTROGEL和SUPEROSE。如果上述纯化步骤c选择了在玻璃上进行层析的话，那么在4-6的酸性pH范围内，碱性的异种蛋白将从das Ancrod溶液中被吸附在玻璃的表面上，同时可以用平衡缓冲液从柱中直接洗脱出纯度远大于95％的das Ancrod。通过加入如氯化钠等的盐可以调节缓冲液所需的离子强度。这种新的方法特别适于制备纯的das Ancrod，而根据该纯化方法所得的das Ancrod的纯度显然高于95％。实施例1a．预纯化将3g干燥的马来腹蛇(der malaiischen Grubenotter)毒液(dasGift)溶解在pH为8.5的50ml Tris(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)-磷酸盐缓冲液中，离心除去蛇毒中不溶的细胞部分，并且将澄清的黄色溶液加入到直径为1.6cm、用DEAE-SEPHAROSE-FF(Pharmacia)装填至高度为30cm的层析柱中。把毒液中的凝血酶样酶以及具有酸性的蛋白质结合到基质上，在150-200ml/h的流速下进行层析。通过在室温下用大约300ml的平衡缓冲液(10mM TRIS-磷酸盐缓冲液，pH 8.5)洗涤该柱直至洗脱物的A280-值下降至小于0.5以及再用pH为6.0的400ml 35mM的TRIS-磷酸盐缓冲液洗涤至洗脱物的A280-值＜0.4时，便洗脱出了大约70-80％的异种蛋白(以在280nm下起始溶液的光密度为基准)。用pH为6.0的150-200ml的150mM TRIS-磷酸盐缓冲液洗脱出含有das Ancrod的主要部分，其收率为85％。b．主要的纯化通过在具有截断阈为10000道尔顿的膜上进行超滤来把含有dasAncrod的洗脱物浓缩至20ml，并用pH为8.0的100mM TRIS-磷酸盐缓冲液重新缓冲。将上述溶液加入到直径为1.6cm并用BIORAN-CPG玻璃(Schott，孔径25-35nm，颗粒尺寸30-60μm)装填到高度为15cm的柱中。通过在室温下用pH为8.0的300ml 100mM的TRIS-磷酸盐缓冲液并在每小时250ml的流速下洗涤柱子，从柱中洗脱出大约60％的异种蛋白(以在280nm下所加物质的光密度为基准)。为了进行洗脱，使用了以100mM的TRIS-磷酸盐缓冲至pH为8.0的0.5M氯化钠溶液。以大约10ml的部分自动收集洗脱物。在一个具有随后的拖尾区的峰处洗脱出凝血酶样酶。为了获得其中最多含5％的凝血酶样次要组分的主要组分(对应于das Ancrod)，在从主峰向脱尾范围的单个部分过渡的过程中通过反相HPLC研究了其纤维蛋白原酶的比活性及其组成。仅把比活性大于1700U/OD280nm并在HPLC中含有少于10％的次要组分的部分与主峰合并(约80ml)。从BIORAN柱中获得了纯度为96％的主要组分，其收率为72％。c．精制的纯化通过在YM 10膜(Amicon)上超滤来把含有主要组分das Ancrod的洗脱物浓缩至2ml，并且把得到的浓缩物加入直径为1.6cm并用SEPHLARYL S-100 HR装填到高度为85cm的柱中。该柱事先已用pH为6.9的100mM氯化钠和100mM磷酸钠的缓冲液平衡。通过上述的凝胶层析从das Ancrod中分离出残余的蛋白酶和TRIS。该步骤的收率约为90％。实施例2a．预纯化将2.1g干燥的马来腹蛇的毒液溶解在pH为8.5的50ml 35mM的TRIS-磷酸盐缓冲液中，离心除去蛇毒中不溶的细胞部分，并且将澄清的黄色溶液加入到直径为1.6cm、用DEAE-SEPHAROSE-FF(Pharmacia)装填至高度为30cm并用上述缓冲液加以平衡的层析柱中。通过在室温下用600ml的平衡缓冲液洗涤柱直至洗脱物的A280值＜0.2时，便洗脱出了大约70％的异种蛋白(以在280nm下起始溶液的光密度为基准)。用pH为6.0的200-250ml 150mM的TRIS-磷酸盐缓冲液洗脱主要的部分，其收率为90-100％。b．主要的纯化与实施例1一样，将上述洗脱物浓缩至20ml，并用pH为8.5的50mM磷酸钠缓冲液重新缓冲。将该溶液本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于从蛇毒中纯化凝血酶样蛋白酶的方法，其特征在于： ａ．通过亲和层析或在碱性离子交换剂上进行层析使蛋白酶的粗产物进行预纯化， ｂ．使含有如上获得的凝血酶样蛋白酶的组分在弱阳离子交换剂上进行层析或者在碱性范围内通过在玻璃上吸附来分离上述组分，以及 ｃ．使来自步骤２的主要组分进行凝胶层析或者在酸性范围内通过在玻璃上进行层析来纯化该组分， 但是其中步骤２和３中的至少一步包括通过在玻璃上层析而进行的分离。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：M施瓦兹，W扎恩，
申请(专利权)人：克诺尔有限公司，
类型：发明
国别省市：DE[德国]