提供了用以将遗传物质导入鸡或其它鸟类细胞中的载体和方法。更具体而言，提供了用以将一种被转基因转移入鸡胚细胞中，从而产生一种该被转基因可在其输卵管内表达并且被转基因产物可分泌入其卵及／或其后代中的转基因雌禽的载体和方法。在一种优选实施方案中，该被转基因产物被分泌入卵清中。（*该技术在2017年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
本专利技术一般地涉及用以将遗传物质导入一鸡胚和其他鸟类胚胎中的载体与方法，更具体而言，涉及用以将一个目的基因转移到鸡胚细胞中以产生这样一种转基因雌禽的载体与方法，目的基因可在该雌禽输卵管中表达且此基因产物可在鸡卵和/或其后代中分泌。
技术介绍
自25年前重组DNA技术发展以来，大规模地生产蛋白质而不是从其天然表达的组织中提取的希望已成为现实。尤其是在近20年中，对表达载体的研究进展使得在实验室规模产生了上千种重组蛋白质。商业化数量的重组蛋白质的生产常常需要困难且昂贵的放大步骤，但也已获得成功。另外，已设计构建了包括鼠、兔、猪、绵羊、山羊及母牛在内的转基因动物，使其组织或分泌物中产生用于人类的药品。Houdebine,L.M.，生物技术杂志(J.Biotechnology)34:269-287(1994)。尽管卵清被认为是产生重组蛋白质的出色宿主，转基因鸟类的制备存在技术上的困难，主要因鸡胚操作过程中出现的诸多问题。当产卵时，胚胎已处于相当于哺乳动物囊胚晚期或原肠胚早期的阶段。在较早期发育阶段过程中胚胎的遗传操作需要重新导入雌性体内或体外培养，这两步都是困难的。Houdebine,L.M.，生物技术杂志(J.Biotechnology)34:269-287(1994)。尽管存在上述困难，已产生了抗鸟造白细胞组织增生病毒感染的转基因鸡(Crittenden和Salter，药用及农用转基因牲畜模型(“Transgenic Livestock Models In Medicine And Agriculture”)73-87(Wiley-Liss(1990)))，或有高水平循环生长激素的转基因鸡。Bosselman,R.A.，等科学(Science)243:533-535(1989)。已报道有四种产生转基因鸟类的常规方法。一种方法涉及自输卵管中切出正在发育的卵，将DNA显微注射入近囊胚层处以及在溶液与替代壳内对所处理的胚胎进行体外培养。Love,J.，等生物技术(Biotechnology)12:60-63(1994)。第二种方法则需培养和转染原生殖细胞，然后移植入照射过的与供体处于同一发育阶段的受体内。Carsience等发育(Development)117:669-675(1993)；Etches等，鸟类科学(PoultryScience)72:882-889(1993)。尽管技术要求很高，上述两种方法仍充满吸引力，因为可以转移大片段DNA。第三种方法涉及用针将可复制的逆转录病毒盲注入(blind injection)新排下的卵的近囊胚层处。Petropoulos,CJ.，等病毒学杂志(J.Virol)65:3728-3737(1991)。虽然此法最简单，但也有局限，因为待转移的DNA大小必须约2kb或更小，而且本方法可产生有病毒血症的雌禽，后者可排出有感染性的重组逆转录病毒。Petropoulos,C.J.，等病毒学杂志(J.Virol)66(6):3391-3397(1992)。第四种涉及一种复制缺陷型逆转录病毒载体系统(见如美国专利No.5,162,215和4,650,764,在此引入作为参考)。这些系统之一衍生于网状内皮组织增生病毒A型(REV-A)(Watanabe和Temin，分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)3(12):2241-2249(1983))。Sevoian等，鸟类疾病(Avian Dis)8:336-347(1964)。来自REV-A的复制缺陷型逆转录病毒载体建立在辅助细胞系C3上(Watanabe和Temin，分子细胞生物学，3(12):2241-2249,(1983))，该细胞系包含有包装缺陷的辅助原病毒组分。在美国专利No.4,650,764及Watanabe和Temin，分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)3(12):2241-2249(1983)中，详细描述了C3辅助细胞系的来源和几种复制缺陷型逆转录病毒载体。与可复制的方法相比，本方法技术要求更高，因为囊胚层必需暴露出来，而且必须使用显微注射设备。Bosselman,R.A.，等科学(Science)243:533-535(1989)。然而，这样可产生没有可复制的逆转录病毒的转基因雌禽，并能转移长达8kb大小的DNA。运用可复制逆转录病毒技术，已在一种转基因鸡中实现一种外源基因的组织特异性表达。Petropoulos,C.J.，等，病毒学杂志(J.Virol)66(6):3391-3397(1992)。一种可复制逆转录病毒被用来将受一肌肉特异性启动子αaction引导的报告基因氯霉素乙酰转移酶(CAT)转移至骨骼肌中。在转基因鸟类的卵中组织特异性地表达重组蛋白质目前尚未获成功。因此，期望提供一种载体和方法用于将基因转入鸡胚(或其他鸟类)细胞中，以产生一种该基因可组织特异性表达的转基因雌禽。同样，期望提供一种载体和方法用于将基因转入鸡胚细胞中，使该基因在雌禽输卵管中表达且此基因产物可分泌入卵中。同样，期望提供一种载体和方法用于将基因转入鸡胚细胞中，使该基因在该雌禽输卵管中表达且此基因产物分泌入雌禽卵中，而无损该雌禽和其它与之有关的鸟类的健康。专利技术概述提供了用以将遗传物质导入小鸡或其它鸟类细胞中的载体和方法。更具体而言，提供了用以将一种被转基因转移入一种鸡胚细胞中，从而产生一种被转基因可在其输卵管内表达并且被转基因产物可分泌入其卵及/或其后代中的转基因雌禽的载体和方法。在一种优选实施方案中，该被转基因产物在卵清中分泌。在一个实施方案中，载体含有一种逆转录病毒基因组的一部分，其能转染细胞但无法进行复制，亦即，一种复制缺陷型逆转录病毒载体。此载体还含有一个被可操纵地连接到适当控制元件上的被转基因，这样该被转基因可以组织特异性地表达。在一个实施方案中，控制元件包括一种引导被转基因在输卵管中表达的增强启动子，一段有恰当长度及序列以增强翻译效率的位于结构基因(编码区)5’端的非翻译区，和一段引导被转基因产物分泌入卵清中的信号序列。在此实施方案中，启动子可以选自卵白蛋白、溶菌酶、伴白蛋白和卵类粘蛋白启动子及其组合且不局限于此。在另一个实施方案中，控制序列包括一种引导被转基因在肝脏表达的启动子和一段引导被转基因产物吸收和分泌入卵黄中的信号序列。在此实施方案中，启动子可以选自卵黄原蛋白和载脂蛋白A启动子及其组合且不局限于此。通过本领域技术人员熟知的方法如上述四种方法，本专利技术中的载体可被用来产生转基因鸟类，尤其是鸡(见专利技术背景)。例如，如引入此处供参考的美国专利No.5,162,215所描述的那样，可用载体将一段核苷酸序列如一个基因导入一种鸡胚的胚细胞及干细胞中。在一个实施方案中，将载体显微注射入一个新排下的鸡卵的接近囊胚层处(如正下方)。然后密封该卵，并孵育至小鸡孵出。然后在该转基因鸡中检测被转基因的表达，如果结果呈阳性且该鸡为雌性(母鸡)的话，则收集这只小鸡的卵并用本领域人员熟知的方法分离蛋白质。如果该鸡为雄性(公鸡)，则饲养之以产生雌性转基因鸡并收集其卵。这样提供了转基因鸟类和卵以及产生转基因鸟类和卵的方法。从下列描述、所附权利要求再加上附图，可以明显看出本专利技术的其它特征及优点。附图简介通过阅读以本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种复制缺陷型逆转录病毒载体，它包括：ａ）一种被转基因；和ｂ）被可操纵地连接到被转基因上且能引导被转基因产物在鸟类卵清中合成的控制元件，其中控制元件包括一种启动子、一段５’非翻译区和一段信号序列。
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：W麦卡瑟，
申请(专利权)人：密执安州立大学执行理事会，
类型：发明
国别省市：US[美国]
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