一种小分子量的丝素肽的分离方法技术

本发明专利技术提供了一种小分子量的丝素肽的分离方法，包括：将家蚕蚕丝脱胶、溶解，得到溶解液；将溶解液加入葡聚糖G10柱中，用灭菌水洗脱，收集得到脱盐的丝素蛋白水溶液；将脱盐的丝素蛋白水溶液冻干，得到冻干后的丝素蛋白；将冻干的丝素蛋白溶解液加入葡聚糖G50柱中，用灭菌水洗脱丝素蛋白，分管收集；筛选步骤d)收集管中1500Da以下的丝素肽，再次加入葡聚糖G15柱中，用灭菌水洗脱丝素肽，分管收集，分离得到1500Da以下的各级小分子量丝素肽。通过本发明专利技术的中性盐溶解结合不同分子筛柱的梯度分离，得到1500Da以下多级别的小分子量丝素肽。同时通过特定的冻干‑溶解的方法使得丝素肽亲水性更好。

【技术实现步骤摘要】
一种小分子量的丝素肽的分离方法
本专利技术涉及纺织
，尤其是涉及一种小分子量的丝素蛋白的分离方法。
技术介绍
家蚕蚕丝是由家蚕合成与分泌的天然动物蛋白，来源广泛，其丝素蛋白具有良好的生物相容性，由20种人体可吸收的氨基酸组成，最终降解产物为氨基酸或小肽，易被细胞吸收或吞噬，不会引起明显的免疫反应，国内外大量的研究表明丝素蛋白材料能够支持多种细胞的生长，所以丝素蛋白是研发护肤品的理想原料。但作为护肤品，能否被皮肤吸收是非常重要的，这对丝蛋白分子量具有一定的要求。在本专利技术作出之前，对丝素蛋白特定分子量的精准分离报导极少。一些报导采用不同脱胶方法、调节丝素溶解温度或不同溶剂等方法制备大分子量丝素蛋白、分子量可控丝素蛋白、中分子量丝素蛋白，这些方法制备的丝素蛋白事实上还是分子量分布较宽的连续分布的混合溶液。不管如何脱胶或溶解，丝素溶解液均是由小分子量到大分子量连续分布的混合溶液，没有分离纯化出真正意义上的并且较精准小分子量范围的丝素蛋白。传统的酸或碱溶解法可以获得小分子量的丝素蛋白，这种方法对丝素的溶解不可控，虽然比起盐溶解法获得了小分子量，但是在丝纤维溶解的同时，会破坏部分氨基酸,极大地影响丝素蛋白分子的生物活性。上述这些已报导的采用溶液透析、滤膜过滤或酸碱溶解的方法获得的丝素溶液掺杂生物提取物，用于护肤品或食品具有异味。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供一种小分子量的丝素肽分离方法，本专利技术的方法制备得到了较窄分子量范围的多级别小分子量的丝素肽，同时亲水性更好，不会影响丝素蛋白分子的生物活性。本专利技术提供了一种小分子量的丝素肽的分离方法，包括：a)将家蚕蚕丝脱胶、加入中性盐溶液溶解，得到丝素蛋白溶解液；b)将丝素蛋白溶解液加入平衡后的葡聚糖SephadexG10柱中，用灭菌水洗脱丝素蛋白，收集流出液，得到脱盐的丝素蛋白水溶液；c)将脱盐的丝素蛋白水溶液冻干，得到冻干后的丝素蛋白；d)将冻干的丝素蛋白溶解液加入平衡后的葡聚糖SephadexG50柱中，用灭菌水洗脱丝素蛋白，分管收集；e)采用SDS-PAGE电泳或质谱筛选步骤d)收集管中1500Da以下的丝素肽，再次加入平衡后的葡聚糖SephadexG15柱中，用灭菌水洗脱丝素肽，分管收集，分离1500Da以下的各级小分子量丝素肽。优选的，步骤a)所述脱胶具体为采用碳酸钠、碳酸氢钠或生物酶进行脱胶。优选的，步骤a)所述中性盐溶液选自溴化锂或氯化钙-乙醇；所述溶解时间为5～7小时；所述丝素蛋白溶解液浓度为10～50mg/mL。优选的，步骤c)还可以为将脱盐的丝素蛋白水溶液倒入聚苯乙烯板内，60～100℃烘干得到丝素蛋白膜。优选的，步骤c)所述冻干后还包括60～100℃热风干燥3～5h。优选的，步骤c)后还包括将冻干后的丝素蛋白浸渍于去离子水中，收集溶解有丝素蛋白的水溶液，冻干，得到再次冻干的丝素蛋白。优选的，所述浸渍的浴比为1:10mg/mL；所述浸渍的时间为1～30min。优选的，所述冻干的丝素蛋白溶解液的浓度为30～80mg/mL。优选的，步骤b)所述洗脱流速为200～400mL/h；步骤d)所述洗脱流速为30～160mL/h；步骤e)所述洗脱流速为8～10mL/h。优选的，步骤e)所述1500Da以下的丝素肽的溶解液的浓度为10～50mg/mL。与现有技术相比，本专利技术提供了一种小分子量的丝素肽的分离方法，包括：a)将家蚕蚕丝脱胶、加入中性盐溶液溶解，得到丝素蛋白溶解液；b)将丝素蛋白溶解液加入平衡后的葡聚糖SephadexG10柱中，用灭菌水洗脱丝素蛋白，收集流出液，得到脱盐的丝素蛋白水溶液；c)将脱盐的丝素蛋白水溶液冻干，得到冻干后的丝素蛋白；d)将冻干的丝素蛋白溶解液加入平衡后的葡聚糖SephadexG50柱中，用灭菌水洗脱丝素蛋白，分管收集；e)采用SDS-PAGE电泳或质谱筛选步骤d)收集管中1500Da以下的丝素肽，再次加入平衡后的葡聚糖SephadexG15柱中，用灭菌水洗脱丝素肽，分管收集，分离得到1500Da以下的各级小分子量丝素肽。通过本专利技术的中性盐溶解结合不同Sephadex分子筛柱的梯度分离，最终获得较窄分子量的1500Da以下多级别的小分子量丝素肽。同时本专利技术通过特定的冻干-溶解的方法使得最终制备得到的丝素肽亲水性更好，同时本专利技术的方法不会影响丝素蛋白分子的生物活性，而且干净去除了掺杂的来自生物体(蚕蛹)的提取物。具体实施方式本专利技术提供了一种小分子量的丝素肽的分离方法，包括：a)将家蚕蚕丝脱胶、加入中性盐溶液溶解，得到丝素蛋白溶解液；b)将丝素蛋白溶解液加入平衡后的葡聚糖SephadexG10柱中，用灭菌水洗脱丝素蛋白，收集流出液，得到脱盐的丝素蛋白水溶液；c)将脱盐的丝素蛋白水溶液冻干，得到冻干后的丝素蛋白；d)将冻干的丝素蛋白溶解液加入平衡后的葡聚糖SephadexG50柱中，用灭菌水洗脱丝素蛋白，分管收集；e)采用SDS-PAGE电泳或质谱筛选步骤d)收集管中1500Da以下的丝素肽，再次加入平衡后的葡聚糖SephadexG15柱中，用灭菌水洗脱丝素肽，分管收集，分离得1500Da以下的各级小分子量丝素肽。本专利技术中所述的小分子量的丝素蛋白中的小分子量指的是1500Da以下的小分子量丝素肽。本专利技术对于家蚕蚕丝不进行限定，本领域技术人员熟知的即可。本专利技术小分子量的丝素肽的分离方法首先将家蚕蚕丝脱胶。本专利技术所述脱胶优选具体为采用碳酸钠、碳酸氢钠或生物酶进行脱胶。更优选具体为将家蚕蚕丝按照特定浴比置于上述碳酸钠、碳酸氢钠或生物酶水溶液中，处理，而后清洗，干燥得到脱胶后的家蚕蚕丝。本专利技术所述特定浴比优选为1:30～60g/mL；所述质量浓度碳酸钠优选0.2～0.6％、碳酸氢钠优选0.5～1.0％、或生物酶1.0～2.5g/L为。所述处理温度碳酸钠优选为95～100℃、碳酸氢钠优选为95～100℃、生物酶优选40～60℃；所述处理次数优选为1～5次；更优选为2～3次；所述每次处理时间优选为30min。所述清洗的溶剂优选为水；更优选为去离子水；本专利技术对于所述清洗的具体操作不进行限定，本领域技术人员熟知的即可。清洗后，拉松，置于50～60℃烘箱内干燥，得到脱胶后的家蚕丝素纤维。本专利技术对于所述拉松的具体操作不进行限定，本领域技术人员熟知的即可。将脱胶后的蚕丝然后加入中性盐溶液溶解，制备丝素蛋白溶解液。在本专利技术中，所述中性盐溶液优选选自溴化锂或氯化钙-乙醇；所述蚕丝与中性盐溶液溶解的浴比优选为1:(10～30)(g/mL)；所述溴化锂溶液的浓度优选为9～10M；所述氯化钙-乙醇中，氯化钙和乙醇的摩尔比优选为1:2；所述溶解时间为5～7小时；所述溶解温度优选为60℃～70℃；更优选为65℃～70℃；所述得到的丝素蛋白溶解液浓度优选为10～50mg/mL。将丝素蛋白溶解液加入平衡后的葡聚糖SephadexG10柱中，用灭菌水洗脱丝素蛋白，收集流出液，得到脱盐的丝素蛋白水溶液。将葡聚糖SephadexG10柱平衡待用。本专利技术对于所述葡聚糖SephadexG10柱的来源不进行限定，可以为市售，也可以为自制。优选具体为：将葡聚糖SephadexG10用灭菌去离子沸水浴至充分膨胀，连续灌入玻璃材质的空芯柱内，自然沉降并用灭菌去本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种小分子量的丝素肽的分离方法，其特征在于，包括：a)将家蚕蚕丝脱胶、加入中性盐溶液溶解，得到丝素蛋白溶解液；b)将丝素蛋白溶解液加入平衡后的葡聚糖Sephadex G10柱中，用灭菌水洗脱丝素蛋白，收集流出液，得到脱盐的丝素蛋白水溶液；c)将脱盐的丝素蛋白水溶液冻干，得到冻干后的丝素蛋白；d)将冻干的丝素蛋白溶解液加入平衡后的葡聚糖Sephadex G50柱中，用灭菌水洗脱丝素蛋白，分管收集；e)采用SDS‑PAGE电泳或质谱筛选步骤d)收集管中1500Da以下的丝素肽，再次加入平衡后的葡聚糖Sephadex G15柱中，用灭菌水洗脱丝素肽，分管收集，分离得1500Da以下的各级小分子量丝素肽。

【技术特征摘要】
1.一种小分子量的丝素肽的分离方法，其特征在于，包括：a)将家蚕蚕丝脱胶、加入中性盐溶液溶解，得到丝素蛋白溶解液；b)将丝素蛋白溶解液加入平衡后的葡聚糖SephadexG10柱中，用灭菌水洗脱丝素蛋白，收集流出液，得到脱盐的丝素蛋白水溶液；c)将脱盐的丝素蛋白水溶液冻干，得到冻干后的丝素蛋白；d)将冻干的丝素蛋白溶解液加入平衡后的葡聚糖SephadexG50柱中，用灭菌水洗脱丝素蛋白，分管收集；e)采用SDS-PAGE电泳或质谱筛选步骤d)收集管中1500Da以下的丝素肽，再次加入平衡后的葡聚糖SephadexG15柱中，用灭菌水洗脱丝素肽，分管收集，分离得1500Da以下的各级小分子量丝素肽。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a)所述脱胶具体为采用碳酸钠、碳酸氢钠或生物酶进行脱胶。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a)所述中性盐溶液选自溴化锂或氯化钙-乙醇；所述溶解时间为5～7小时；所述丝素蛋白溶解液浓度为10～50mg/mL。4.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：王建南，张玲，裔洪根，
申请(专利权)人：苏州大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32