本发明专利技术提供了一种美洲大蠊抗菌肽AMP‑PA‑10，所述的抗菌肽的氨基酸序列为SEQ ID No.1；编码所述的抗菌肽AMP‑PA‑10的基因的核苷酸序列为SEQ ID No.2。本发明专利技术还提供了所述抗菌肽的制备方法：(1)抗菌肽AMP‑PA‑10基因的合成；(2)抗菌肽AMP‑PA‑10表达载体的构建以及鉴定；(3)抗菌肽AMP‑PA‑10原核表达载体的构建；(4)抗菌肽AMP‑PA‑10的获得。本发明专利技术所述的抗菌肽AMP‑PA‑10具有明显的抑菌作用，尤其是对金黄色葡萄球菌和沙门氏杆菌；所述的抗菌肽AMP‑PA‑10对绿脓杆菌也具有抑制作用。所述的抗菌肽AMP‑PA‑10具有很高的研发价值，具体的可以应用于医药、日化、食品或保健领域。
A kind of antibacterial peptide AMP PA 10 preparation method and application thereof
【技术实现步骤摘要】
一种美洲大蠊抗菌肽AMP-PA-10及其制备方法和应用
本专利技术属于基因工程领域，特别是涉及一种美洲大蠊抗菌肽AMP-PA-10及其制备方法和应用
技术介绍
蜚蠊是分化较早的一类有翅类昆虫，分布广泛、种类多，在全球约有4000多个种，但真正与人居关系密切、称为卫生害虫的不过30种。有些种类携带多种致病细菌、霉菌、病毒、寄生虫卵和原虫包囊等病原体，有文献报道蟑螂能携带约40种病原体，通过机械性兼生物性传播多种人类疾病，对人类身体健康构成直接或间接的危害，同时其排泄物和蜕落的表皮是室内主要的吸入性过敏原之一，可以诱发哮喘、过敏性鼻炎等过敏性性疾病。过去人们对蜚镰的研究主要集中在害虫的防治方面，但这类昆虫能够适应恶劣的环境条件，在进化过程可能形成了其独特的防御体系，能够产生高活性的生物活性物质，因此人们也逐渐认识和发现了蜚镰有可供人类利用的医药价值。先天性免疫是多细胞生物抵抗细菌、真菌、病毒等入侵机体的第一道防线。多细胞生物通过快速合成和分泌抗菌肽来消灭微生物，完成先天性免疫反应。昆虫抗菌肽(antimicrobialpeptides，AMPs)主要在脂肪体和多种上皮细胞中合成。当昆虫受到外界微生物刺激，分泌至血淋巴中的抗菌肽就能直接扩散到整个昆虫机体。抗菌肽的协同自噬反应、级联信号受体过程共同保护宿主不受微生物入侵。自1975年Boman等从天蚕(hyatophoracecropia)蛹中分离得到第1种抗菌肽天蚕素后，现已有259种昆虫AMP相继被分离和功能注释。抗生素的发现使人们对由病原微生物感染引发的各类疾病不再束手无策，但抗生素的长期使用，导致病原微生物耐药性的广泛产生，现迫切需要寻找新一代抗菌剂。而抗菌肽的抗菌活性、对宿主具有最小的毒性和低灵敏度效应的特性，都使抗菌肽最有希望成为新的、安全的、可以替代传统抗菌素的一种抗生素。从自然源分离AMP成本高，资源有限，且只对天然肽有用；化学合成能产生天然或经修饰的AMP，但代价高，所以需要有效且经济的合成方法。用基因工程重组技术在宿主细胞内合成AMP是目前较为经济且有效的方法，易于大规模生产，还可改造、合成AMP基因。目前，未见利用基因工程制备美洲大蠊抗菌肽的报道。
技术实现思路
针对现有技术缺陷，本专利技术是通过将目的基因与pYES2-NTA酿酒酵母表达载体先进行连接，得到真核表达载体PYES2-NTA-AMP-PA-10质粒，然后再从构建好的真核表达载体PYES2-NTA-AMP-PA-10质粒中扩增目的基因，合成目的基因后通过构建原核表达载体进行融合蛋白的诱导表达，最后进行目的蛋白的分离纯化得到本专利技术所述的抗菌肽AMP-PA-10。进一步，本专利技术的目的在于提供一种美洲大蠊抗菌肽AMP-PA-10。进一步，本专利技术的目的还在于提供一种编码所述抗菌肽的基因及其合成方法。进一步，本专利技术还提供了所述的美洲大蠊抗菌肽AMP-PA-10的原核表达方法。本专利技术所述的美洲大蠊抗菌肽AMP-PA-10的氨基酸序列为SEQIDNo.1。编码所述的美洲大蠊抗菌肽AMP-PA-10的基因的核苷酸序列为SEQIDNo.2。所述的美洲大蠊抗菌肽AMP-PA-10的制备方法是通过以下方法实现的：(1)抗菌肽AMP-PA-10基因的合成：目的基因AMP-PA-10的合成；(2)抗菌肽AMP-PA-10表达载体的构建以及鉴定：将步骤(1)获得的目的基因AMP-PA-10与pET-32a(+)质粒通过双酶切后再连接而获得的连接产物转入DH5α感受态细胞中，通过菌液PCR将阳性克隆的菌液送出测序，从测序正确的菌液中提取重组质粒，即得；(3)抗菌肽AMP-PA-10原核表达载体的构建：将步骤(2)中获得的重组质粒转化至表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)并检测，获得正确的原核表达菌株；(4)抗菌肽AMP-PA-10的获得：将步骤(3)中测序正确的菌株进行诱导培养后，再经过菌体破碎，层析，透析，酶切，透析，分离纯化，即得抗菌肽AMP-PA-10。其中，步骤(1)中所述的目的基因AMP-PA-10的合成方法是通过以下步骤实现的：a.DNA模板的制备：构建真核表达载体PYES2-NTA-AMP-PA-10质粒作为DNA模板；b.根据PYES2-NTA-AMP-PA-10质粒的序列特点来设计引物P3和P4，在AMP-PA-10的5'端添加EcoRI酶切位点，3'端添加XhoI酶切位点，同时都加入酶切保护碱基。c.根据步骤b中所设计的上、下游引物以步骤a中所述的真核表达载体PYES2-NTA-AMP-PA-10为模板进行PCR扩增，回收纯化PCR产物，即得目的基因AMP-PA-10。进一步，步骤b中所述的引物P3的序列为5'CCGGAATTCAATAAGTTTGAATATCGAAC3'；引物P4的序列为5'CCGCTCGAGACTCCTCTCGACTTTTTC3'。进一步，所述的引物P3序列中黑体部分为EcoRI酶切位点，下划线部分为酶切保护碱基；引物P4序列中黑体部分为XhoI酶切位点，下划线部分为酶切保护碱基。进一步，步骤c中所述的PCR反应体系为25μl体系，具体的为：PYES2-NTA-AMP-PA-10质粒和Taq酶各0.5μl，上、下游引物各1μl，buffer2.5μl，dNTP1.5μl，ddH2O18μl。进一步，步骤c中所述的PCR程序为：95℃预变性5min；94℃变性30S；62.3℃退火30S；72℃延伸20S，循环35次；72℃终延伸10min。其中，步骤(4)中所述的诱导培养条件为：将测序正确的菌株接种到100ug/mlAmpLB液体培养基中，37℃，200rpm过夜振荡培养11h，按1:100的比例取其并加入100ug/mlAmpLB液体培养基中，37℃，200rpm振荡培养至OD值达0.5～0.6后，加入IPTG使诱导浓度达0.4mM。30℃，200rpm振荡诱导培养3.5h。其中，步骤(4)中所述的分离纯化条件参数为：将酶切样品透析到0.01MPBS中，经12000rpm离心后，选用GES200-24上样；以缓冲液：0.01MPBS,PH7.4，30mMNaCl，流速0.2ml/min，进行洗脱。本专利技术所述的抗菌肽AMP-PA-10基因的核苷酸序列长度为132bp。本专利技术所述的抗菌肽AMP-PA-10具有明显的抑菌作用，尤其是对金黄色葡萄球菌和沙门氏杆菌；所述的抗菌肽AMP-PA-10对绿脓杆菌也具有抑制作用。本专利技术所述的抗菌肽AMP-PA-10具有很高的研发价值，具体的可以应用于医药、日化、食品或保健领域。附图说明图1总RNA提取电泳图图2真核表达载体PYES2-NTA-AMP-PA-10扩增琼脂糖凝胶电泳图图3抗菌肽AMP-PA-10目的基因扩增琼脂糖凝胶电泳图图4重组质粒转入DH5α感受态细胞中菌液PCR琼脂糖凝胶电泳图图5重组质粒转入BL21大肠杆菌中菌液PCR琼脂糖凝胶电泳图图612％SDS-PAGE诱导产物验证图712％SDS-PAGE菌体破碎后产物验证图8Tricine-SDS-PAGE酶切检测图9目的蛋白的AKTA分离纯化曲线图10目的蛋白的Tricine-SDS-PAGE检测图11金黄色葡萄球菌抑菌实验结果图12沙门氏杆菌抑菌实验结果图13绿脓杆本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种美洲大蠊抗菌肽AMP‑PA‑10，其特征在于，所述的抗菌肽的氨基酸序列为SEQ ID No.1。
【技术特征摘要】
1.一种美洲大蠊抗菌肽AMP-PA-10，其特征在于，所述的抗菌肽的氨基酸序列为SEQIDNo.1。2.根据权利要求1所述的抗菌肽AMP-PA-10，其特征在于，编码所述的抗菌肽AMP-PA-10的基因的核苷酸序列为SEQIDNo.2。3.如权利要求1所述的美洲大蠊抗菌肽AMP-PA-10的制备方法，其特征在于，所述的制备方法是通过以下方法实现的：(1)抗菌肽AMP-PA-10基因的合成：目的基因AMP-PA-10的合成；(2)抗菌肽AMP-PA-10表达载体的构建以及鉴定：将步骤(1)获得的目的基因AMP-PA-10与pET-32a(+)质粒通过双酶切后再连接而获得的连接产物转入DH5α感受态细胞中，通过菌液PCR将阳性克隆的菌液送出测序，从测序正确的菌液中提取重组质粒，即得；(3)抗菌肽AMP-PA-10原核表达载体的构建：将步骤(2)中获得的重组质粒转化至表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)并检测，获得正确的原核表达菌株；(4)抗菌肽AMP-PA-10的获得：将步骤(3)中测序正确的菌株进行诱导培养后，再经过菌体破碎，层析，透析，酶切，透析，分离纯化，即得抗菌肽AMP-PA-10。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述的目的基因AMP-PA-10的合成方法是通过以下步骤实现的：a.DNA模板的制备：构建真核表达载体PYES2-NTA-AMP-PA-10质粒作为DNA模板；b.根据PYES2-NTA-AMP-PA-10质粒的序列特点来设计引物P3和P4，在AMP-PA-10的5'端添加EcoRI酶切位点，3'端添加XhoI酶切位点，同时都加入酶切保护碱基。c.根据步骤b中所设计的上、下游引物以步骤a中所述的真核表达载体PYES2-NTA-AMP-PA-10为模板进行PCR扩增，回收纯化PCR产物，即得目的基因AMP-PA-10。5....
【专利技术属性】
技术研发人员：刘越飞，耿福能，岳碧松，
申请(专利权)人：四川好医生攀西药业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：四川,51
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