GnRH-白细胞毒素嵌合体制造技术

一种嵌合体蛋白，它含有与第一个和第二个多聚体融合的白细胞毒性多肽，其中第一个多聚体的Ｃ末端与白细胞毒素多肽的Ｎ末端融合，第二个多聚体的Ｎ末端与白细胞毒素多肽的Ｃ末端融合，另外其中每个所述的多聚体含有一个以上的选定ＧｎＲＨ多肽。（*该技术在2017年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

总的来说本专利技术涉及免疫学载体系统。更具体地说，本专利技术涉及白细胞毒素GnRH嵌合体，它包括一个以上的GnRH多肽的拷贝。与单独的GnRH多肽比较，该嵌合体显示出增强的免疫原性。
技术介绍
在脊椎动物中，两种促性腺激素，促黄体素(LH)和促卵泡激素(FSH)的合成和释放称为促性腺素释放激素(GnRH)(过去称为LHRH)的多肽的调节。因此，一条控制动物群体的生育的途径是降低GnRH的水平，如通过抗GnRH的免疫接种，这一方法使LH和FSH的水平降低，并伴随着破坏发情周期和精子生成。参见例如Adams等人，动物科学杂志(1990)68:2793-2802。对GnRH分子的早期研究已经表明在对重复注射合成的GnRH肽的应答中产生抗血清是可能的(Arimura等人，内分泌学(1973)93(5):1092-1103)。另外，在许多种类中，通过将GnRH与适当的载体化学地共轭并以适当的助剂中的共轭物给药已经产生抗GnRH的抗体(Carelli等人，美国核酸科学进程(1982)79:5392-5395)。已经叙述过将含有GnRH或GnRH类似物的重组融合蛋白用于肽疫苗中，以便对各种驯养的和农场的动物进行免疫去雄或抑制它们的生育功能(Meloen等人，疫苗(1994)12(8):741-746；Hoskinson等人，澳大利亚生物技术杂志(1990)4:166-170；和1992年11月12日公开的国际公开号，WO92/19746；1991年3月7日公开的WO91/02799,1990年10月4日公开的WO90/11298,1986年12月公开的WO86/07383)。但是，由于不能提供适当的免疫学绝育产品这样的尝试失败，因为GnRH肽的免疫原性较小，和化学共轭方案难于控制，使GnRH共轭物基本上是异源的并且不确定的事实。另外，基于GnRH的肽疫苗在对单个动物个体提供均一的效果的成功率是有限的，甚至在重复接种后。关于这一点，过去的GnRH构建体不能提供均一的成功的免疫绝育疫苗产品，因为GnRH是小的“自体”分子，个体的免疫系统不能正常识别，使该分子的免疫原性较小，并且内在地不能诱导对内源GnRH的明显的免疫应答。通常认为通过生产这些含有选定的表位的多重拷贝的分子的免疫原性形式可以明显地提高病毒抗原，小蛋白或内源物质的免疫原性。在这一点上，基于1型单纯疱疹病毒糖蛋白D的肽9-12的两个或四个重复(Ploeg等人，免疫学方法杂志(1989)124:211-217)，恶性疟原虫抗原疟的原虫四肽NPNA的两个到六个重复(Lowell等人，科学(1988)240:800-802)，口啼疫疾病病毒的VP1的主要免疫原位点的两个或四个拷贝(Broekhuijsen等人，J.gen.Virol.(1987)68:3137-3143)和类似GnRH的多肽的任意重复(Meloen等人，疫苗(1994)12(8):741-746)的构建体已经表明能有效地增加这些分子的免疫原性。为了在受到攻击的寄主中引专利技术显的免疫应答，将小蛋白或内源物质也可以与适当的载体共轭。通常适当载体是多肽，包括起源于感染物质的蛋白质如病毒表面蛋白，或载体肽序列的抗原区。这些载体的作用是非特异地刺激T辅助细胞的活性，和帮助指导抗原到提供抗原的细胞以便在细胞表面加工和呈现该肽，该肽与主要的组织相容性复合物(NHC)的分子结合。为了这一目的，已经研制了几个载体系统。例如，小肽抗原经常与蛋白质载体如匙孔血蓝蛋白(Bittle等人，自然(1982)298:30-33)，破伤风类毒素(Muller等人，美国核酸科学进程(1982)79:569-573)，卵清蛋白，和鲸精子肌红蛋白偶联，产生免疫应答。这些偶联反应通常导致在每摩尔的载体蛋白中掺入几摩尔的肽抗原。虽然肽抗原以多重拷贝呈现通常能增强免疫原性，载体可以引发与肽抗原不相关的强免疫性，这可以抑制次级免疫接种的肽疫苗的免疫应答(Schutze等人，免疫学杂志(1985)135:2319-2322)。抗原传递系统也是基于颗粒载体的。例如，可以将预先形成的颗粒用作平台，抗原可以与其偶联和掺入其中。已经开发的有基于蛋白体(Lowell等人，科学(1988)240:800-802)，免疫刺激复合物(Morein等人，自然(1984)308:457-460)，和病毒颗粒如HBsAg(Neurath等人，分子免疫学(1989)26:53-62)，和轮状病毒内部衣壳蛋白(Redmond等人，分子免疫学(1991)28:269-278)的系统。利用重组生产的嵌合蛋白也已经设计了载体系统，该嵌合蛋白可以自我组装成颗粒。例如，酵母逆转录转座子，Ty，编码一系列蛋白，可以组装成类似病毒颗粒(Ty-VLPs；Kingsman,S.M.，和A.J.Kingsman疫苗(1988)6:304-306)。已经将外源基因插入TyA基因并在酵母中以融合蛋白形式表达。融合蛋白保留了自我组装成均一大小的颗粒的能力。已经检测了其它嵌合蛋白颗粒如HBsAg,(Valenzuela等人，生物/技术(1985)3:323-326；美国专利号，4,722,840；Delpeyroux等人，科学(1986)233:472-475)，乙型肝炎核心抗原(Clarke等人，疫苗88(Ed.H.Ginsberg，等人，1988)pp.127-131)，脊髓灰质炎病毒(Burke等人，自然(1988)332:81-82)和烟草花叶病毒(Haynes等人，生物/技术(1986)4:637-641)。但是，这些载体的用途受到限制，因为活性试剂的大小有限，它可以插入结构蛋白而不干扰颗粒的组装。最后，利用与选定的抗原融合的溶血性巴斯德菌白细胞毒素(LKT)多肽已经设计了嵌合系统。参见，例如1993年4月29日公开的国际公开号WO93/08290,1992年3月5日公开的WO92/03558以及美国专利号5,238,823和5,273,889。通过提供具有广谱种类反应性的T-细胞表位，肽抗原嵌合体中的LKT载体部分的内含物提供的对嵌合体的免疫原性增强，从而在免疫接种个体中引发了依赖于T细胞的免疫应答。在这点上，在产生对嵌合体的肽抗原部分的免疫应答中诱导适当的T细胞辅助是必要的，特别是其中抗原是内源分子。但是，到现在为止，还没有叙述将白细胞毒素多肽载体与GnRH肽的多重表位结合使用。本专利技术公开内容本专利技术基于溶血性巴斯德菌(P.haemolytica)白细胞毒素基因，其突变体，和编码多个GnRH多肽的一个或多个核苷酸序列之间构建新基因融合体。当与GnRH单独给药引发的免疫原性反应比较时，这些构建体产生免疫原性惊人地增强的嵌合蛋白。所以，在一个实施方案中，本专利技术涉及含有与一个或多个多聚体融合的白细胞毒素多肽的嵌合蛋白，其中每个多聚体含有不止一个选定的GnRH多肽。该嵌合体的白细胞毒素部分的作用是增强GnRH多肽的免疫原性。更具体地说，本文所用的GnRH多聚体可以对应于不止一个拷贝的选定的GnRH多肽或表位，或选定的GnRH多肽或表位的多个任意重复。另外，GnRH多聚体可以定位于白细胞毒素多肽的羧基和/或氨基末端，白细胞毒素多肽的内部位点，或任何这样的位点的联合。每个GnRH多聚体也本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：安德鲁·A·波特，约翰·G·曼斯，
申请(专利权)人：萨斯喀彻温大学，
类型：发明
国别省市：