核糖体S6蛋白激酶制造技术

本发明专利技术提供了一种新的多核苷酸，由该多核苷酸编码的多肽，以及利用所述多核苷酸生产多肽的方法。更具体的说，本发明专利技术的多肽是核糖体Ｓ６蛋白激酶。（*该技术在2018年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种新的多核苷酸，由该多核苷酸编码的多肽，这些多核苷酸和多肽的应用，以及所述多核苷酸和所述多肽的生产。更具体地说，本专利技术的多肽是核糖体S6蛋白激酶。在细胞分裂增殖过成中，细胞对各种丝裂原样物质的反应涉及到多种丝氨酸专一的蛋白激酶的活化，其中RSK(ribosomalprotein S6 kinase)就是其中之一。这种激酶在丝裂原刺激的细胞中对核糖体的40S亚基的S6蛋白进行多个丝氨酸残基的磷酸化。核糖体40S亚基的S6蛋白进行多个丝氨酸残基的磷酸化。核糖体S6蛋白的磷酸化最初是在肝再生中被发现，此后许多研究证明，在多种丝裂原和原癌基因产物激活的细胞中都发生了S6磷酸化，此外，卵细胞在孕酮或胰岛素作用下的分裂也伴随着S6的磷酸化。自1985年以来，不断有具S6蛋白激酶活性的酶及其基因的报道。这些酶根据分子量和结构的不同可分为两个亚族，即Mr＝9200-9000的p90rsk亚族和Mr＝6500-7000的p70rsk亚族。p90rsk亚族的最初成员--一个Mr＝92000的蛋白激酶S6KII，是最先从未受精的爪蟾卵中分离得到的。相继分离的是一个Mr＝90000的蛋白激酶S6KI。利用S6KII蛋白的胰蛋白酶水解片段序列设计的寡核苷酸探针于爪蟾中克隆了一系列cDNA，氨基酸序列分析表明，其所编码的蛋白包含两个催化区域N端催化区和C端催化区。N端催化区和蛋白激A/C家族有48％的相似度，C端催化区与磷酸化酶b的催化亚单位非常相似。利用爪蟾S6KIIαcDNA，Alcorta等在鸡和小鼠中分离了三个cDNA克隆，三个克隆所编码的蛋白与爪蟾S6KIIα蛋白有79％的相似度。其中鸡和小鼠的一个cDNA(rskch和rskmo-1，长度分别为3.7kb和3.1kb)分别编码了含752和724个氨基酸的蛋白。另一小鼠的非全长cDNA(rskmo-2)所编码的肽的C端的633个氨基酸与爪蟾S6KIIα的C端非常相近。1990年Rey Huei等在鸡CEF细胞，小鼠Swiss3T3细胞和人Hela细胞中检测到了具有p90rsk活性的蛋白。1994年David.E.Moller等报道了与小鼠RSK基因(rskmo-1和rskmo-2)同源的三个人类cDNA(Hu-1，Hu-2，Hu-3)的克隆。根据推测的氨基酸序列与rskmo-1和rskmo-2进行比较，发现Hu-1(全长3061bp，编码735个氨基酸)与rskmo-1和rskmo-2的相似度分别为95％和84％，Hu-2(1728bp，非全长)则分别为80％和99％。Hu-3(1700bp，非全长)的相似度比较小，分别为75％和84％。通过染色体定位，确定Hu-1在3号染色体，Hu-2在6号染色体，Hu-3在X染色体。1995年该实验室又克隆了一个新的RSK cDNA(RSK3，最长开读框为2202bp，编码733个氨基酸)，并将之定位于6号染色体q27区。根据与rskmo-1和rskmo-2的比较，RSK3与rskmo-1的相似度比与rskmo-2的相似度大，分别为84％和37％。除了脊椎动物，RSK基因在无脊椎动物中也有发现。1994年DavidWassarman等在果蝇中克隆了一个RSK DNA，其最大开读框为2730bp。RSK家族的另一亚族-p70rsk亚族包括具S6蛋白激酶活性的，分子量在65000-70000之间的蛋白激酶。除了在分子量和结构上与p90rsk亚族不同外，两者的功能也有差异。p70rsk已陆续在鸟类，小鼠，兔和牛细胞中发现。1990年Benerjee R.L.等在大鼠的cycloheximide处理的肝细胞中分离了一个70kd的S6激酶，cDNA序列分析表明，其蛋白结构中只包含一个催化区域。此催化区域的氨基酸顺序与大鼠p85 S6蛋白激酶的N端蛋白激酶C相似区有56％的相似度。在此催化区的330个氨基酸之外，两者是迥异的。同年Kozma S.C.等分离了两个大鼠编码p70 S6蛋白激酶的cDNA克隆，分别编码了502和525个氨基酸的的蛋白，除了N端的23个氨基酸为后者独有外，其余的氨基酸序列都相同。利用大鼠的这两个克隆，Grove J.R.等在1991年分离了人类的两个相应的cDNA克隆(p70 S6蛋白激酶αI，525个氨基酸；p70 S6kαII，505个氨基酸)。氨基酸比较的结果与大鼠的两个cDNA克隆相同。RSK基因与人类疾病的关系少见报道，1996年Elisabeth Trivier发现人类RSK-2基因的突变与Coffin-Lowry症有关。这表明对人类RSK基因的研究不仅有其重要的理论意义而且可能较大的医学价值。因此，本专利技术的一个目的是提供一种新的多核苷酸，该多核苷酸编码核糖体S6蛋白激酶。本专利技术的另一个目的是提供一种新的核糖体S6蛋白激酶，命名为Hums6pkh。本专利技术的再一个目的是提供一种利用重组技术生产所述的新的核糖体S6蛋白激酶的方法。本专利技术涉及一种新的多核苷酸，由该多核苷酸编码的多肽，以及利用所述多核苷酸生产所述多肽的方法。更具体地说，本专利技术的多肽是新的核糖体S6蛋白激酶。编码本专利技术的多核苷酸可以是RNA形式和DNA形式，DNA包括cDNA、基因组DNA和合成DNA，DNA可以是双链或单链，如果是单链，可以是编码链或非编码链。在本专利技术中，术语“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内天然状态下的多核苷酸和多肽是没有分离的，但同样的多核苷酸或多肽如从天然状态中同存的其他物质中分开，则为分离的。在本专利技术的一个实施方案中，本专利技术的多核苷酸全长为2331个核苷酸，其详细序列见SEQ ID NO1，其中开放读框位于86-1495位核苷酸。该多核苷酸是如此获得的，以人肌肉λgt11cDNA文库(购自Clontech公司)为模板，合成正向引物5’-CCTTGATGCTTTACATAGAGAG-3’，和反向引物5’-CCAAGTCGTTCCAGAGGATTGAA-3’，进行PCR，获得283bp的目的片段。然后标记该片段，以该标记片段为探针与扩增后的人肌肉λgt11cDNA文库杂交，挑取阳性克隆，经同样的探针及筛选过程对得到的阳性克隆进行复筛后，最终得到若干阳性单克隆。鉴定测序后得到SEQ ID NO1的全长cDNA序列。根据本专利技术的另一方面，本专利技术的多核苷酸序列可用来表达或生产重组的蛋白或多肽。一般来说有以下步骤用本专利技术的编码Hums6pkh的DNA片段(或变异体)或含有该DNA片段的重组表达载体转化合适的宿主细胞；在合适的培养基中培养的宿主细胞；从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。本专利技术还涉及含有本专利技术的多核苷酸序列的表达载体及用所述的表达载体遗传工程化的宿主细胞。表达载体的一个重要特征是含有适当的启动子和翻译控制元件。多种表达载体可从商业途径得到。常用的载体包括(但不限于)质粒，噬菌体，粘粒，酵母表达载体，病毒，Ti质粒等，但最常用的载体首选质粒。常用的宿主细胞包括(但不限于)细菌，酵母，昆虫细胞，动物细胞或植物细胞等，但最常用的宿主细胞为细菌，尤其是大肠杆菌。另一个较常用的表达系统是哺乳动物细胞系，如Hela，COS细胞系或CHO细胞系本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离出的多核苷酸，其编码具有ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２的推导的氨基酸序列的多肽或者所述多肽的片段、类似物或衍生物，所述的片段、类似物或衍生物具有与全长多肽相同的生物学功能。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：余龙，张宏来，屠强，傅强，赵勇，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]