基于核糖体２８Ｓ－ｒＲＮＡ对叶螨分属的快速鉴定方法技术

本发明专利技术是基于核糖体２８Ｓ－ｒＲＮＡ对叶螨分属的快速鉴定方法，属于农业生物技术范畴。２８Ｓ－ｒＲＮＡ对叶螨分属的快速鉴定方法是测定叶螨不同属物种的一段特定２８Ｓ－ｒＲＮＡ序列，通过序列分析软件计算各物种遗传距离和构建系统发育树，从而对各物种进行快速区分。本发明专利技术根据叶螨２８Ｓ－ｒＲＮＡ基因序列设计了一对新的特异性引物，可扩增出多态性的目的片段，长度约为５４７－５７８ｂｐ。本发明专利技术所述叶螨分属的快速鉴定方法迅速、简单、可靠，既节约成本，又省时高效。用核糖体２８Ｓ－ｒＲＮＡ分子鉴定技术可广泛用于叶螨分属水平上的鉴定。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
基于核糖体２８Ｓ－ｒＲＮＡ对叶螨分属的快速鉴定方法，其特征在于：　　１）提取叶螨总ＤＮＡ　　挑单头雌成螨放入２５μｌ　ＳＴＥ缓冲液中进行碾磨，加入２μｌ　１０ｍｇ／ｍｌ蛋白酶Ｋ，３７℃孵育３０ｍｉｎ后，９５℃初始变性５ｍｉｎ并使蛋白酶Ｋ失活，作为ＤＮＡ模板用于ＰＣＲ扩增，ＳＴＥ缓冲液配制：１００ｍＭＮａＣｌ，１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，１ｍＭ　ＥＤＴＡ，ｐＨ　８．０，提取ＤＮＡ；　　２）ＰＣＲ扩增　　根据ＧｅｎＢａｎｋ上登录的叶螨２８Ｓ－ｒＲＮＡ的基因片段，利用Ｐｒｉｍｅｒ５．０软件设计了一对特异性引物：即上游引物２８Ｓ－Ｆ：５’－ＡＡＣＧＡＧＡＴＴＣＣＣＡＣＴＧＴＣＣＣ－３’和下游引物２８Ｓ－Ｒ：５’－ＧＣＣＴＴＡＧＧＡＣＡＣＣＴＧＣＧＴＴＡ－３’，以提取的叶螨总ＤＮＡ作为ＤＮＡ模板，反应体系：　　ｄｄＨ↓［２］Ｏ　３０．６μＬ　　１０×Ｂｕｆｆｅｒ　５μＬ　　Ｍｇ↓［２］Ｃｌ　２５ｍＭ　５μＬ　　ＤＮＴＰ　２．５ｍＭ　４μＬ　　Ｐｒｉｍｅｒ　２８Ｓ－Ｆ　２０μＭ　１．５μＬ　　Ｐｒｉｍｅｒ　２８Ｓ－Ｒ　２０μＭ　１．５μＬ　　Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶５Ｕ／μｍ　０．４μＬ　　ＤＮＡ模板　２．０μＬ　　总体积　５０μＬ　　扩增条件：　　预变性：９４℃，４ｍｉｎ；　　３０个循环：变性９２℃，１ｍｉｎ，退火５５℃，１ｍｉｎ，延伸７２℃，１ｍｉｎ；　　３）克隆和测序：利用ＡＸＹＧＥＮ回收试剂盒对ＰＣＲ产物进行纯化，再将纯化产物连接到ｐＧＥＭ－Ｔ载体，最后导入感受态大肠杆菌ＤＨ５ａ中进行振荡培养，挑取培养基中长出的白斑，在ＬＢ培养液中培养，将菌液送到测序公司进行测序，每个种群取三个样品进行克隆和测序，以它们的一致序列为准；４）序列数据分析　　获得的未知物种ＤＮＡ序列用ＢＬＡＳＴ工具进行检索并从Ｇｅｎｅｂａｎｋ下载同源性相近的物种序列，下载序列要求：同一属不同物种２条以上，至少３个不同属；对同源性ＤＮＡ序列用Ｃｌｕｓｔａｌ　Ｘ　１．８１软件进行序列比对生成ａｌｎ文件；将生成的ａｌｎ文件用ＭＥＧＡ　４．０１软件转换生成ｍｅ、文件；采用距离法计算各样间的遗传距离，遗传距离小于２％的为同一属的物种，遗传距离远大于２％的为不同属的物种；基于ｐ－ｄｉｓｔａｎｃｅ模型，用邻接法构建系统发育树，通过１０００次检验获得系统树分支的置信度；同一属的物种以９９％的置信度处在同一进化枝上，未知物种获得属种分类。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：洪晓月，李国庆，孙荆涛，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]