从干细胞产生功能细胞制造技术

本公开提供了一种使干细胞直接转化成谱系特异性细胞的方法，所述方法包括以下步骤：a)用至少一种表达载体转染干细胞，所述表达载体包含i)与诱导型启动子可操作地连接的一种或多种细胞谱系重编程因子和ii)选择标记；以及b)用诱导剂诱导来自步骤a)的所述转染的干细胞以使所述干细胞直接转化成谱系特异性细胞。特别举例说明了用与强力霉素诱导型启动子连接的SA‑ASCL1(磷酸化突变体)、DLX2、LHX6以及miR‑9/9*‑124转染干细胞以使所述干细胞转化成抑制性神经元以及用与强力霉素诱导型启动子连接的NeuroD2转染以使干细胞转化成兴奋性神经元的方法。还提供了筛选调节所述谱系特异性细胞的预选活性的一种或多种因子和/或一种或多种遗传突变的方法、试剂盒以及使用本发明专利技术的方法获得的可直接转化的干细胞。

Producing functional cells from stem cells

The invention provides a method of making stem cells directly into lineage specific cells, wherein the method comprises the following steps: a) with at least one expression vector was transfected into stem cells, the expression vector containing I promoter and inducible) operatively connected to one or more cell lineage reprogramming factor and II) markers; and b) with inducers from step a) the transfected stem cells to make the stem cells directly into specific cell lineages. Especially illustrated with doxycycline inducible promoter SA ASCL1 connection (phosphorylation mutant), DLX2, LHX6 and miR 9/9* 124 transfection of stem cells to make the stem cells into inhibitory neurons and with doxycycline inducible promoter NeuroD2 transfectants connected to stem cells into method the excitability of neurons. A method, kit for screening one or more factors and / or one or more genetic mutations regulating the preselected activity of the pedigree specific cells and the directly transformed stem cells obtained by the method of the invention are provided.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】从干细胞产生功能细胞对相关申请的交叉引用本申请要求2015年4月10日提交的新加坡申请号10201502869T的优先权益，该新加坡申请的内容在此以引用的方式整体并入本文用于所有目的。
本专利技术大体上涉及生物
具体来说，本专利技术涉及用于使多潜能或多能干细胞分化成多个细胞谱系的方法。本专利技术进一步涉及用于执行如本文所述的方法的培养基和试剂盒。
技术介绍
在多个发育关头，谱系特异性转录因子(TF)将多能祖细胞导向单一谱系结果并且阻遏替代命运，从而确保单方面谱系决定。使诸如人类多潜能干细胞(hPSC)的干细胞分化成定向细胞类型的能力对于细胞替代治疗、药物筛选和发现、功能障碍的机制研究以及其它下游应用来说具有很大的益处。干细胞可以分化成的细胞谱系的实例是神经元谱系。使干细胞分化成神经元谱系的细胞的各种方法是已知的。这些方法模拟了在神经元的生物发生期间发生的发育信号转导以产生神经祖细胞并且随后使这些祖细胞分化成功能神经元。然而，这些方法通常涉及需要重组生长因子和小分子的不同组合的多个中间阶段，并且最终产生具有可变的功能特性的非神经元细胞和神经元细胞这两者的混合物。获得神经元的成熟和突触能力所需的延长的时间线是另一限制，这是因为该过程可能需要长达30周。因此，需要一种克服或至少修正了上述缺点中的一个或多个的从干细胞获得功能谱系特异性细胞的方法。
技术实现思路
在一个方面，提供了一种使干细胞直接转化成谱系特异性细胞的方法，所述方法包括：a)用至少一种表达载体转染所述干细胞，所述表达载体包含i)与诱导型启动子可操作地连接的一种或多种细胞谱系重编程因子以及ii)选择标记；以及b)用诱导剂诱导所述来自步骤a)的转染的干细胞以使所述干细胞直接转化成至少一种谱系特异性细胞。在另一个方面，提供了一种产生可直接转化的干细胞的方法，所述方法包括以下步骤：a)用表达载体转染干细胞，所述表达载体包含i)与诱导型启动子可操作地连接的一种或多种细胞谱系重编程因子以及ii)与组成型启动子可操作地连接的选择标记；以及b)针对所述选择标记的表达筛选所述转染的干细胞以产生所述可直接转化的干细胞，其中所述可直接转化的干细胞能够直接转化成诱导的谱系特异性细胞。在一个方面，提供了一种可直接转化的干细胞，所述干细胞包含i)与诱导型启动子可操作地连接的一种或多种重编程因子以及ii)与组成型启动子可操作地连接的选择标记，其中所述可直接转化的干细胞能够直接转化成诱导的谱系特异性细胞。在一个方面，提供了一种筛选一种或多种因子和/或一种或多种遗传突变的方法，所述一种或多种因子和/或一种或多种遗传突变调节根据前述技术方案中的任一个诱导的谱系特异性细胞的预选活性的，所述方法包括以下步骤：a)在一种或多种因子和/或一种或多种遗传突变存在下培养所述诱导的谱系特异性细胞；b)测量步骤a)的所述谱系特异性细胞的预选活性；以及c)比较b)的所述测量值与在所述一种或多种因子或所述一种或多种因子遗传突变不存在下培养的所述谱系特异性细胞中的所述预选活性的测量值，其中c)中的所述谱系特异性细胞的预选活性的测量值的差异表明所述一种或多种因子或所述一种或多种遗传突变调节所述谱系特异性细胞的预选活性。在一个方面，提供了一种用于产生诱导的谱系特异性细胞的试剂盒，所述试剂盒包括：a)如本文所述的可直接转化的干细胞；b)诱导剂；以及任选的使用说明书。在一个方面，提供了一种使干细胞直接转化成谱系特异性细胞的方法，所述方法包括：用至少一种表达载体转染所述干细胞，所述表达载体包含i)与组成型启动子可操作地连接的一种或多种细胞谱系重编程因子。在一个方面，提供了一种使干细胞直接转化成谱系特异性细胞的方法，所述方法包括：用至少一种表达载体转染所述干细胞，所述表达载体包含i)与诱导型启动子可操作地连接的一种或多种细胞谱系重编程因子。在一个方面，提供了一种可直接转化成抑制性神经元的干细胞，所述干细胞包含：i)与强力霉素诱导型启动子连接的SA-ASCL1、DLX2、LHX6以及miR-9/9*-124；以及ii)与组成型启动子可操作地连接的选择标记。在一个方面，提供了一种可直接转化成兴奋性神经元的干细胞，所述干细胞包含：i)与强力霉素诱导型启动子连接的NeuroD2；以及ii)与组成型启动子可操作地连接的选择标记。在另一个方面，提供了一种使用通过本文所公开的方法获得的细胞筛选药剂的方法，所述方法包括：i)使所述细胞与所述药剂接触；ii)测量所述药剂对所述细胞的预选活性并且将此与没有接触所述药剂的细胞进行比较；以及iii)检测所述药剂对所述细胞的活性。定义如本文所用的术语“干细胞”包括但不限于未分化细胞，它们是由它们在单细胞水平上自我更新和分化以产生后代细胞的能力来定义的，包括自我更新祖细胞、非更新祖细胞、以及终末分化的细胞。举例来说，“干细胞”可以包括(1)全能干细胞；(2)多潜能干细胞；(3)多能干细胞；(4)寡能干细胞；以及(5)单能干细胞。如本文所用的术语“全能性”指的是具有形成成体以及胚胎外组织(包括胎盘)中的所有细胞的发育潜能的细胞。受精卵(合子)是全能的，桑椹胚(直到受精后的16细胞期)的细胞(卵裂球)也是全能的。如本文所用的术语“多潜能干细胞”(PSC)指的是具有发育潜能以在不同的条件下分化成所有三个生殖细胞层，即内胚层(例如肠组织)、中胚层(包括血液、肌肉、以及血管)、以及外胚层(如皮肤和神经)的特征性细胞类型的细胞。细胞分化成所有三个胚层的发育能力可以使用例如裸小鼠畸胎瘤形成测定来确定。在一些实施方案中，多潜能性还可以通过胚胎干(ES)细胞标志物的表达来证实，尽管使用本文所述的组合物和方法产生的细胞或细胞群体的多潜能性的优选测试是证实细胞具有分化成这三个胚层中的每一个的细胞的发育潜能。如本文所用的术语“诱导多潜能干细胞”或iPSC意指干细胞是由分化的成体细胞产生，所述分化的成体细胞已经被诱导或改变，即重编程成能够分化成以下所有三个胚层或真皮层的组织的细胞：中胚层、内胚层、以及外胚层。所产生的iPSC不是指在自然界中发现的细胞。如本文所用的术语“胚胎干细胞”指的是胚胎胚泡的内细胞团的天然存在的多潜能干细胞。这样的细胞可以类似地从源自于体细胞核转移的胚泡的内细胞团获得。胚胎干细胞是多潜能的并且在发育期间产生以下三个初级胚层的所有衍生物：外胚层、内胚层以及中胚层。换句话说，当针对特定细胞类型给予足够的和必要的刺激时，它们可以发育成成体的超过200种细胞类型中的每一种。它们不会促成胚胎外膜或胎盘，即不是全能的。如本文所用的术语“多能干细胞”指的是具有分化成一个或多个胚层的细胞的发育潜能的细胞而非具有分化成所有三个胚层的细胞的发育潜能的细胞。因此，多能细胞也可以被称作“部分分化细胞”。多能细胞是本领域公知的，并且多能细胞的实例包括成体干细胞，例如像造血干细胞和神经干细胞。“多能”表示细胞可以形成给定谱系中的许多类型的细胞，而不是其它谱系的细胞。举例来说，多能造血细胞可以形成许多不同类型的血细胞(红细胞、白细胞、血小板等)，但是它不能形成神经元。因此，术语“多能性”指的是具有小于全能和多潜能的发育潜能程度的细胞状态。如本文所用的术语“分化”是未特化(“未定向”)或不太特化的细胞获得例如像神经细胞或本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种使干细胞直接转化成谱系特异性细胞的方法，所述方法包括：a)用至少一种表达载体转染所述干细胞，所述表达载体包含i)与诱导型启动子可操作地连接的一种或多种细胞谱系重编程因子以及ii)选择标记；以及b)用诱导剂诱导来自步骤a)的所述转染的干细胞以使所述干细胞直接转化成谱系特异性细胞。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.04.10 SG 10201502869T1.一种使干细胞直接转化成谱系特异性细胞的方法，所述方法包括：a)用至少一种表达载体转染所述干细胞，所述表达载体包含i)与诱导型启动子可操作地连接的一种或多种细胞谱系重编程因子以及ii)选择标记；以及b)用诱导剂诱导来自步骤a)的所述转染的干细胞以使所述干细胞直接转化成谱系特异性细胞。2.如权利要求1所述的方法，其中所述至少一种表达载体包含与组成型启动子可操作地连接的选择标记。3.如权利要求2所述的方法，所述方法进一步包括在诱导所述细胞之前选择用于表达所述选择标记的转染的干细胞的步骤。4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述选择标记是选自由以下各项组成的组的抗生素抗性基因：嘌呤霉素、杀稻瘟菌素、潮霉素、博莱霉素、以及新霉素。5.如权利要求2所述的方法，其中所述组成型启动子选自由以下各项组成的组：磷酸甘油酸激酶(PGK)、延伸因子1-α(EF1α)、β-肌动蛋白和巨细胞病毒(CMV)增强子/鸡β-肌动蛋白启动子(CAG)以及泛素C(UBC)。6.如前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法进一步包括用表达载体转染所述干细胞的步骤，所述表达载体包含能够在诱导剂存在下诱导所述诱导型启动子的反式激活因子。7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述诱导剂选自由强力霉素和Cumate组成的组。8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述表达载体是整合载体或非整合载体。9.如权利要求8所述的方法，其中所述整合载体是逆转录病毒表达载体或慢病毒表达载体。10.如权利要求8所述的方法，其中所述非整合载体是仙台病毒、腺相关病毒(AAV)或游离型DNA。11.如前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法进一步包括使用一个或多个选择步骤富集所选择的细胞的步骤。12.如权利要求11所述的方法，其中所述选择步骤选自由以下各项组成的组：抗生素选择、荧光激活细胞分选(FACS)、磁激活细胞分选(MACS)、或单克隆分离和扩增。13.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述干细胞是胚胎干细胞(ESC)或诱导多潜能干细胞(iPSC)。14.如权利要求13所述的方法，其中所述干细胞是灵长类动物干细胞或非灵长类动物干细胞。15.如权利要求14所述的方法，其中所述灵长类动物干细胞是人类干细胞。16.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述干细胞是干细胞系。17.如权利要求16所述的方法，其中所述干细胞系被培养成二维细胞培养物或三维细胞培养物。18.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中以至少70％的效率产生所述谱系特异性细胞。19.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述谱系特异性细胞是被培养成二维细胞培养物或三维细胞培养物的细胞的群体。20.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述谱系特异性细胞是外胚层谱系、中胚层谱系或内胚层谱系的细胞。21.如权利要求20所述的方法，其中所述外胚层谱系的细胞是神经细胞。22.如权利要求21所述的方法，其中所述神经细胞选自由以下各项组成的组：兴奋性神经元、抑制性神经元、多巴胺神经元、血清素神经元、中型多棘神经元、基底前脑胆碱能神经元、少突胶质细胞、星形胶质细胞以及运动神经元。23.如权利要求22所述的方法，其中所述神经细胞是兴奋性神经元。24.如权利要求22所述的方法，其中所述神经细胞是抑制性神经元。25.如权利要求21所述的方法，其中所述神经细胞是皮层网络的至少一种细胞。26.如权利要求20所述的方法，其中所述中胚层谱系的细胞是心脏细胞。27.如权利要求26所述的方法，其中所述心脏细胞选自由以下各项组成的组：心肌细胞、内皮细胞、血管平滑肌细胞(VSMC)以及心脏成纤维细胞。28.如权利要求20所述的方法，其中所述内胚层谱系的细胞是肝脏细胞。29.如权利要求28所述的方法，其中所述肝脏细胞选自由以下各项组成的组：肝细胞、库柏法细胞、星状细胞以及窦状内皮细胞。30.如权利要求1至29中任一项所述的方法，其中所述谱系特异性细胞存在于均质的细胞群体中。31.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一种或多种重编程因子选自由以下各项组成的组：转录因子、染色质重塑因子、表观遗传修饰因子和/或非编码RNA。32.如权利要求31所述的方法，其中所述非编码RNA是微小RNA。33.如权利要求31所述的方法，其中所述转录因子是神经转录因子。34.如权利要求33所述的方法，其中所述神经转录因子是选自由以下各项组成的组的一种或多种转录因子：Ngn1、Ngn2、Ngn3、NeuroD1、NeuroD2、Brn1m、Brn2m、Brn3A、Brn3B、Brn3C、Brn4、Dlx1、Dlx2、Ascl1、转录因子Ascl1的磷酸化死亡突变体(SA/SV-Ascl1)、CTIP2、MYT1L、Olig1、Zic1、Nkx2.1、nkx2.2、Lhx2、Lhx3、Lhx6、Lhx8、SATB1、SATB2、Dlx5、Dlx6、Fezf2、Fev、Lmx1b、Lmx1a、Pitx3、Nurr1、FoxA2、Sox11、Atoh7、Olig2、Ptf1a、MEF2c、p55DD(显性负)、Nkx6.1、Nkx6.2、Sox10、ST18、Myrf、Myt1、Zfp536、hes1、hes5、hes6、SOX2、SOX9、PAX6、NFIA、NFIB、NFIX、NICD、Islet1、Islet2、Irx3、Dbx2以及TAL1。35.如权利要求31所述的方法，其中所述转录因子是心脏转录因子。36.如权利要求35所述的方法，其中所述心脏转录因子是选自由以下各项组成的组的一种或多种转录因子：Isl1、Mef2、Gata4、Tbx5、Nppa、Cx40、MESP1、MYOCD和ZFPM2、Baf60c、Hand2、Hopx、Hrt...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙徐扬，林滨，
申请(专利权)人：新加坡科技研究局，
类型：发明
国别省市：新加坡,SG