一种梯度致密性荧光水凝胶及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开一种梯度致密性荧光水凝胶及其制备方法和应用。所述水凝胶包括A液及B液，A液：取0‑4重量份多聚甲醛、0.8重量份NaCl、0.3重量份Na2HPO4·12H2O、0.02重量份KCl和0.02重量份KH2PO4，去离子水定容至NaCl浓度为0.008g/ml后55℃溶解；冷却至4℃后调节pH至6.8‑7.6；加入0.025‑0.15重量份荧光微球、5‑15重量份丙烯酰胺、0.025‑0.075重量份N,N‑亚甲基二丙烯酰胺，4℃溶解后加入0.078重量份四甲基乙二胺和0.05‑0.2重量份过硫酸铵并震荡混匀。该水凝胶具有超强的耐组织透明处理性，可对大组织内的血管结构进行稳定荧光标记。

A gradient compact fluorescent hydrogel and its preparation and Application

The present invention discloses a gradient compactness fluorescent hydrogel and its preparation method and application. The hydrogel including A solution and B solution, A solution: take 0 4 weight paraformaldehyde and 0.8 weight portions of NaCl, Na2HPO4, 12H2O, 0.3 weight weight 0.02 KCl and 0.02 KH2PO4 weight, the volume at NaCl concentration of deionized water was 0.008g/ml after 55 DEG to 4 DEG C after cooling dissolution; pH adjusted to 6.8 7.6; 0.025 into 0.15 parts by weight of fluorescent microspheres, 5 15 weight portions of acrylamide, 0.025 0.075 weight portions of N, N two methylene acrylamide, 4 C dissolved after adding 0.078 weight portions of four methyl ethylenediamine and 0.05 0.2 parts by weight of ammonium persulfate and turbulence mixing. The hydrogels have super strong tissue and transparent processing, which can be used to stabilize the vascular structure in large tissues.

【技术实现步骤摘要】
一种梯度致密性荧光水凝胶及其制备方法和应用
本专利技术涉及生物医药领域，具体涉及一种梯度致密性荧光水凝胶及其制备方法和应用。
技术介绍
血管标记在解剖学和病理学的相关研究中具有极其广泛的应用。随着光学扫描层切技术和多种组织透明技术的发展及应用，在三维水平上对大组织中具有荧光信号的精细结构的三维重建在生命科学及医学方面的研究日趋广泛。要实现大组织中血管精细网络结构的三维重建，就需要对血管的精细结构进行荧光标记，且该荧光标记需对组织透明处理具有良好的耐受性。然而，针对目前已有的任何一种组织透明技术，尚没有这样一种对透明处理过程具有良好的耐受性又能对血管精细网络结构进行稳定荧光标记的方法。已有的组织透明技术能在保持组织内原有荧光蛋白的荧光信号及蛋白和核酸原有结构特征的前提下实现大组织的透明，结合光学扫描层切技术可对大组织中具有荧光标记的结构进行三维重建。但这些技术不能同时荧光标记血管等精细结构。如能对血管精细结构进行透明耐受性处理并荧光标记，则可以实现大组织乃至整个器官中血管精细网络结构的三维重建。结合自身特定细胞表达特异性荧光蛋白的转基因动物及分通道扫描成像技术，更可进一步为评价血管与其它组织结构的相关关系提供可靠的研究方法。传统的血管标记途径包括对血管进行荧光染料填充和对血管进行特异性的免疫荧光染色。通过荧光染料填充法标记的血管在对组织进行透明处理后存在严重的染料流失和荧光淬灭现象，从而无法对精细的血管结构进行标记。在透明后的大组织中采用免疫荧光染色标记血管存在抗体难以渗入组织内部和免疫结合不完全等难题，无法实现精细血管结构的荧光标记。
技术实现思路
为解决现有技术中存在的问题，专利技术人等进行了深入研究，进而提供一种适用于对透明组织中精细血管网络进行荧光标记的新型梯度致密性荧光水凝胶，该新型梯度致密性荧光水凝胶具有超强的耐组织透明处理特性，并可对大组织内部的血管结构进行稳定的荧光标记。通过该水凝胶的应用可在组织透明处理后保留精细血管结构内的稳定荧光标记，进而可实现大组织中血管精细网络结构的三维重建。具体地，本专利技术提供一种梯度致密性荧光水凝胶的制备方法，其包括下述步骤：A液配制：将0-4重量份多聚甲醛、0.8重量份NaCl、0.3重量份Na2HPO4·12H2O、0.02重量份KCl和0.02重量份KH2PO4，用去离子水定容至NaCl的浓度为0.008g/ml后55℃溶解；冷却至4℃后调节pH至6.8-7.6；加入0.025-0.15重量份荧光微球、5-15重量份丙烯酰胺、0.025-0.075重量份N,N-亚甲基二丙烯酰胺，4℃溶解后加入0.078重量份四甲基乙二胺和0.05-0.2重量份过硫酸铵并震荡混匀，现配现用；B液配制：取2-6重量份丙烯酰胺、0.25重量份VA-044、0.8重量份NaCl、0.3重量份Na2HPO4·12H2O、0.02重量份KCl和0.02重量份KH2PO4，用4℃去离子水定容到丙烯酰胺的浓度为0.02-0.06g/ml后4℃过夜溶解，调节pH至6.8-7.6。其中，所述荧光微球的粒径为100-500nm。此外，所述B液于0-4℃储存。此外，所述荧光微球的荧光激发光谱为330-550nm。此外，所述荧光微球为聚苯乙烯荧光微球。本专利技术提供一种如上所述的制备方法制得的梯度致密性荧光水凝胶。本专利技术还提供一种如上所述的梯度致密性荧光水凝胶的应用，其以A液对血管进行填充，实现组织中精细血管结构的荧光标记；以B液对组织进行固定和包埋，在组织中形成低于血管中密度的水凝胶结构，锁定组织中的核酸与蛋白，然后对组织进行透明处理，利用荧光显微镜进行光学层切，实现透明的大组织中精细血管结构的三维荧光标记，结合三维重建技术进一步构建血管精细网络结构的三维模型。其中，所述以水凝胶中的A液对血管进行填充，是在0-4℃的低温环境中，依次采用PBS和A液对组织进行灌流，灌流完成后立即将组织至于20-37℃环境中使A液发生聚合反应。此外，所述以B液对组织进行固定和包埋，是在A液的聚合反应后，将组织置于4℃4％PFA溶液中固定12h后置于B液中0-4℃过夜，然后将组织置于密闭容器中，抽真空后注入氮气，然后置于35-38℃摇床上使B液发生聚合反应。用该水凝胶中的A液对血管进行填充，即可实现组织中精细血管结构的荧光标记。再用B液对组织进行固定和包埋以在组织中形成梯度致密性的水凝胶结构，然后对组织进行透明处理，最后利用荧光显微镜进行光学层切，则可实现透明的大组织中精细血管结构的三维荧光标记。结合三维重建技术可进一步构建血管精细网络结构的三维模型。该水凝胶的应用高效地解决了传统荧光染料填充法标记血管后在组织透明处理过程中染料流失问题。统计学分析显示，与传统荧光染料填充法相比，采用新型水凝胶标记的血管透明处理后其线密度增加了7.84倍，血管线分支点密度增加了19.74倍。附图说明图1是耐组织透明处理的梯度致密性荧光水凝胶有效标记血管的精细结构。图1A是组织中精细血管结构的荧光标记；图1B是荧光染料常规填充血管后进行透明处理会因染料大量流失而无法标记血管精细结构图；图1C是采用新型水凝胶标记的血管透明处理后其线密度；图1D是血管线分支点密度示意图。图2是利用耐组织透明处理的梯度致密性荧光水凝胶进行大组织中血管精细网络结构的三维标记与重建示意图。图2A是耐组织透明处理的梯度致密性荧光水凝胶标记血管后获得大组织中血管精细网络结构的三维视图；图2B是图2A中白框区域的局部放大，显示精细血管网络的三维结构；图2C是图2B中血管网络结构的三维重建。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术进行详述，但本专利技术并不限定于这些实施例。一、梯度致密性荧光水凝胶反应体系的制备实施例1A液配制：(1)取4g多聚甲醛(PFA)、0.8gNaCl、0.3gNa2HPO4·12H2O、0.02gKCl和0.02gKH2PO4，用去离子水定容至100ml后55℃溶解。冷却至4℃后调节pH至7.5。加入37.5mg聚苯乙烯荧光微球(粒径100-500nm)、10g丙烯酰胺(Sigma，V900845-1KG)、0.05gN,N-亚甲基二丙烯酰胺(Sigma，CAS110-26-9)，4℃溶解后加入100μl四甲基乙二胺和1ml10％过硫酸铵并震荡混匀。现配现用。B液配制：取4g丙烯酰胺(Sigma，V900845-1KG)、0.25gVA-044(都莱生物，AIBI25g)、0.8gNaCl、0.3gNa2HPO4·12H2O、0.02gKCl和0.02gKH2PO4，用4℃去离子水定容到100mL后4℃过夜溶解，调节pH至7.5。在4℃存储，有效存储时间小于一周。实施例2A液配制：(1)取2g多聚甲醛(PFA)、0.8gNaCl、0.3gNa2HPO4·12H2O、0.02gKCl和0.02gKH2PO4，用去离子水定容至100ml后55℃溶解。冷却至4℃后调节pH至6.8。加入25mg聚苯乙烯荧光微球(粒径100-500nm)、5g丙烯酰胺(Sigma，V900845-1KG)、0.025gN,N-亚甲基二丙烯酰胺(Sigma，CAS110-26-9)，4℃溶解后加入100μl四甲基乙二胺和2ml10％过硫酸铵并震荡混匀。现配现用。B液配制：取2g丙烯本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种梯度致密性荧光水凝胶的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：A液配制：取0‑4重量份多聚甲醛、0.8重量份NaCl、0.3重量份Na2HPO4·12H2O、0.02重量份KCl和0.02重量份KH2PO4，用去离子水定容至NaCl的浓度为0.008g/ml后55℃溶解；冷却至4℃后调节pH至6.8‑7.6；加入0.025‑0.15重量份荧光微球、5‑15重量份丙烯酰胺、0.025‑0.075重量份N,N‑亚甲基二丙烯酰胺，4℃溶解后加入0.078重量份四甲基乙二胺和0.05‑0.2重量份过硫酸铵并震荡混匀，现配现用；B液配制：取2‑6重量份丙烯酰胺、0.25重量份VA‑044、0.8重量份NaCl、0.3重量份Na2HPO4·12H2O、0.02重量份KCl和0.02重量份KH2PO4，用4℃去离子水定容到丙烯酰胺的浓度为0.02‑0.06g/ml后4℃过夜溶解，调节pH至6.8‑7.6。

【技术特征摘要】
1.一种梯度致密性荧光水凝胶的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：A液配制：取0-4重量份多聚甲醛、0.8重量份NaCl、0.3重量份Na2HPO4·12H2O、0.02重量份KCl和0.02重量份KH2PO4，用去离子水定容至NaCl的浓度为0.008g/ml后55℃溶解；冷却至4℃后调节pH至6.8-7.6；加入0.025-0.15重量份荧光微球、5-15重量份丙烯酰胺、0.025-0.075重量份N,N-亚甲基二丙烯酰胺，4℃溶解后加入0.078重量份四甲基乙二胺和0.05-0.2重量份过硫酸铵并震荡混匀，现配现用；B液配制：取2-6重量份丙烯酰胺、0.25重量份VA-044、0.8重量份NaCl、0.3重量份Na2HPO4·12H2O、0.02重量份KCl和0.02重量份KH2PO4，用4℃去离子水定容到丙烯酰胺的浓度为0.02-0.06g/ml后4℃过夜溶解，调节pH至6.8-7.6。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述荧光微球的粒径为100-500nm。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述B液于0-4℃储存。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述荧...

【专利技术属性】
技术研发人员：张胜祥，成晓峰，谢文广，赵瑾，张浩力，曹晶晶，龚晓婷，
申请(专利权)人：兰州大学，
类型：发明
国别省市：甘肃,62