具有溶酶体定位功能的硅基罗丹明铜离子荧光探针及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种具有溶酶体定位功能的硅基罗丹明铜离子荧光探针，其结构如式(I)所示；所述的荧光探针能够选择性识别铜离子，且具有定位于细胞中溶酶体的功能；优点：本发明专利技术的硅基罗丹明铜离子探针能够特异性定位于细胞的溶酶体中，并能够实现对溶酶体内铜离子的监测。该探针的激发和发射波长均位于近红外光区，在应用于生物成像时可以降低生物体自身荧光背景的干扰，且穿透能力强，对活体组织或细胞的损伤较小，可以满足近红外荧光检测的要求。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及化学和生物成像
，具体地说，是具有溶酶体定位功能的硅基 罗丹明铜离子荧光探针及其制备方法和应用。
技术介绍
铜元素是生物体必须的微量元素，也是人体内含量排在锌铁之后、位居第三的过 渡元素，广泛分布于生物组织中，对于中枢神经系统、免疫系统、骨骼及内脏组织的发育和 功能有着重要影响。铜元素是许多金属蛋白和酶的重要组成部分、如金属硫蛋白、环氧合酶 C0X、细胞色素 C氧化酶、铜-锌超氧化物歧化酶等，参与生物体内的细胞呼吸、抗氧化、神经 递质及结缔组织的生物合成、天然色素的形成等过程。生物体内铜含量的失衡会导致蛋白 质、脂类、DNA和其它生物分子的氧化性损伤，导致生长和代谢的紊乱，并可能引发Menkes、 Wilson、Parkinson 和 Alzheimer 等疾病。 溶酶体是真核细胞中由单层膜包被的囊状结构，溶酶体内pH( ? 4.5)低于胞浆内 pH( ? 7.0)，内含多种水解酶和内分泌蛋白，能对细胞经吞噬作用、胞吞作用等吸收的大分 子进行消化分解。溶酶体还在胆固醇的动态平衡、质膜的修复、骨组织的重塑、病原体防御 等过程中发挥重要作用。溶酶体能够多方面调控细胞的凋亡过程，与肿瘤的发生发展有着 密切的联系。 溶酶体与生物体铜离子的代谢有着密切的关系，例如肝细胞通过溶酶体可以将细 胞内多余的铜离子运送到细胞外，最后进入胆汁中排出体外，因此检测溶酶体的铜离子有 着重要的生理意义。荧光检测法具有灵敏度高、响应时间短等优点，被广泛应用于细胞的成 像研究中，但由于溶酶体内特殊的酸性环境，对探针的稳定性、酸性条件下的识别性能等提 出了更高的要求，因此特异性检测溶酶体内铜离子的荧光探针鲜有报道。Cong Wu等人报道 了一个基于罗丹明的含六元螺环的铜离子探针(〇rg.Lett. ,2012,14,4198-4201 )，但没有 用于细胞成像实验中；Xiaobo Wang等人报道了一个基于ICT机理的铜离子荧光探针，并且 具有溶酶体靶向功能(Chem.Commun.，2013，49，11263-11265)，但是该探针属于荧光减弱型 探针，灵敏度较差，且检测波长不能够满足近红外检测的要求。专利中也有许多关于铜离子 荧光探针的报道，例如专利CN 102127421 A、CN103664971 A、CN 104087285 A、CN 101914102 A等，这些专利中报道的铜离子探针均无法定位于细胞内溶酶体，且检测波长均 无法满足近红外检测的要求。中国专利201510010745.0,公开日2015年1月公开了一种用于 细胞内铜离子荧光成像的纳米探针及其制备方法，该探针具有尺寸均一、结果稳定、毒性 低、生物相容性好的优点。中国专利201410552491.0,公开日2014年10月公开了一种基于罗 丹明B的Cu 2+探针及其制备方法，该探针在pH= 7.2的HEPES缓冲溶液中为无色，加入铜离子 后，迅速变为红色，可通过肉眼直接观测颜色变化从而测定水样中部低于6μΜ的铜离子。以 上所述荧光探针都能较好的特异性识别铜离子，但其以荧光素和罗丹明为母体结构，激发 波长和发射波长在可见光区，且不具备溶酶体特异性定位功能。我们知道，细胞溶酶体内为 酸性环境，对探针的稳定性、酸性条件下的识别性能等提出了更高的要求，因此设计合成具 有溶酶体靶向的铜离子荧光探针具有良好的应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中的不足，提供一种具有溶酶体定位功能的硅基罗 丹明铜离子荧光探针。 本专利技术的再一的目的是，提供如上所述硅基罗丹明铜离子荧光探针的制备方法。 本专利技术的另一的目的是，提供如上所述硅基罗丹明铜离子荧光探针的用途。 为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案是： -种具有溶酶体定位功能的硅基罗丹明铜离子荧光探针，所述的荧光探针为SiR-Cu，其结构如式(I)所示;所述的荧光探针能够选择性识别铜离子(Cu 2+)，且具有定位于细胞 中溶酶体的功能； ，" t Do所述的荧光探针检测pH值为4.5-9.0;优选为5-7;最优为6。所述的焚光探针最大激发波长为667nm，最大发射波长为680nm〇 为实现上述第二个目的，本专利技术采取的技术方案是： -种制备如上所述具有式（I)结构的硅基罗丹明铜离子荧光探针的方法，包括如 下步骤： 1)将2-NH2-SiR 与CSCh反应生成2-NCS-SiR; 2)将2-NCS-SiR与肼反应生成探针SiR-Cu; 具体制备方法如下： 1)将4.0当量CSC12溶于干燥CH2CI2中，冰浴，将1.0当量2-NH2_SiR溶于CH2CI2中，缓 慢加入CSC1 2的CH2C12溶液中，再加入4.0当量NaOH，冰浴下反应并慢慢升至室温，反应4小时 后，加入0.1M碳酸钠水溶液，继续反应0.5小时，CH 2C12萃取，CH2C12层用无水硫酸钠干燥，蒸 干溶剂，得固体2-NCS-SiR; 2)将固体2-NCS-SiR用乙腈溶解，缓慢加入20.0当量85 %水合肼，室温下反应4小 时，蒸干溶剂，CH2C12萃取，无水硫酸钠干燥，硅胶柱层析，得探针SiR-Cu。为实现上述第三个目的，本专利技术采取的技术方案是： 如上所述硅基罗丹明铜离子荧光探针在检测细胞溶酶体内铜离子及细胞溶酶体 荧光成像中的应用。所述的检测为体外样品检测。 如上所述的硅基罗丹明铜离子荧光探针在制备铜离子检测试剂中的应用。所述的 试剂可特异性定位于细胞中溶酶体。所述铜离子为Cu 2+。 如上所述的硅基罗丹明铜离子荧光探针在制备细胞染料、生物染色剂、生物分子 或生物粒子的铜离子荧光标记物中的应用，所述的铜离子荧光标记物具有溶酶体定位功 能。本专利技术优点在于： 本专利技术设计并合成出一种新型硅基罗丹明铜离子探针，该探针能够特异性定位于 细胞的溶酶体中，并能够实现对溶酶体内铜离子的检测。该探针的激发和发射波长均位于 近红外光区，在应用于生物成像时可以降低生物体自身荧光背景的干扰，且穿透能力强，对 活体组织或细胞的损伤较小，可以满足近红外荧光检测的要求。【附图说明】 附图1为本专利技术的探针SiR-Cu的核磁氢谱图。 附图2为本专利技术的探针SiR-Cu的核磁碳谱图。附图3为本专利技术的探针SiR-Cu在不同pH条件下激发光波长为620nm时，680nm处的 荧光变化图。 附图4为本专利技术的探针SiR-Cu在pH为7.4条件下加入不同当量铜离子的荧光光谱 图。 附图5为本专利技术的探针SiR-Cu在pH为5.0条件下加入不同当量铜离子的荧光光谱 图。附图6为本专利技术的探针SiR-Cu在pH为5.0与7.4条件下选择性实验结果。附图7为本专利技术的探针SiR-Cu对人正常肝细胞(L02)染色激光共聚焦荧光成像效 果图。附图8为本专利技术的探针SiR-Cu对人肝癌细胞(HepG2)激光共聚焦荧光成像效果图。 附图7、附图8中，（a)均表示激发光为633nm时激光共聚焦荧光成像效果图；（b)均 表示激发光为488nm时激光共聚焦荧光成像效果图；（c)均表示细胞明场效果图；（d)均表示 (a)、（b)、（c)的叠加效果图。 附图9为探针Rh-Cu在不同pH下激发波长540nm，检测波长588nm荧光变化图。【具体实施方式】下面结合【具体实施方式】，进一步阐本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种具有溶酶体定位功能的硅基罗丹明铜离子荧光探针，其特征在于，所述的荧光探针为SiR‑Cu，其结构如式(I)所示；所述的荧光探针能够选择性识别铜离子，且具有定位于细胞中溶酶体的功能；

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：汪亭，王保刚，柴晓云，吴秋业，张志强，付奔，
申请(专利权)人：中国人民解放军第二军医大学，
类型：发明
国别省市：上海;31