胃泌素17检测试剂盒及其制备方法技术

本发明专利技术涉及医学免疫学中荧光免疫层析技术领域，具体地说是一种胃泌素17检测试剂盒及制备方法，设有试纸卡，其特征在于所述试纸卡设有由下自上依次设有：PVC板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其中结合垫上吸附有稀土荧光微球标记的胃泌素17单克隆抗体，所述稀土荧光微球的直径为60‑120nm，稀土荧光微球掺杂稀土镧系元素，在基态下稳定，在340‑380nm的激发光源作用下发射出波长范围在540‑600nm的荧光；所述单克隆抗体为纯化后混合的单克隆抗体，来源于针对2‑6个不同的胃泌素17抗原表位的单克隆抗体细胞株，具有操作简便、反应快速、灵敏度高、特异性强等优点。

Detection kit for gastrin 17 and its preparation method

The present invention relates to medical immunology fluorescence immunochromatographic technology field, in particular to a gastrin 17 detection kit and a preparation method thereof, a test card, which is characterized in that the test card is provided with a self are provided on the PVC board, sample pad, combination pad, nitrate cellulose membrane and absorbent pad among them, the conjugate pad adsorption of rare earth fluorescent microspheres labeled 17 gastrin monoclonal antibody, the fluorescent microspheres with diameter of 60 120nm, rare earth fluorescent microspheres doped with rare earth lanthanum, stable in the ground state, as to emit fluorescence wavelengths in the range of 540 with 600nm under 340 380nm excitation light source; monoclonal antibodies of the monoclonal antibody was purified from the mixture, for 2 6 different gastrin 17 epitopes of monoclonal antibodies, and has the advantages of simple operation, quick response, sensitive It has the advantages of high degree, strong specificity and so on.

【技术实现步骤摘要】
胃泌素17检测试剂盒及其制备方法
：本专利技术涉及医学免疫学中荧光免疫层析
，具体地说是一种能够快速准确的对胃泌素17进行定量分析的胃泌素17检测试剂盒及其制备方法。
技术介绍
：血清胃泌素17(gastrin17，G17)是由胃肠道G细胞分泌的多肽类激素，其与胆囊收缩素受体(cholecystokininreceptor，CCKR)结合后通过一系列信号转导而发挥生物学效应，主要参与刺激胃酸分泌及营养胃肠道黏膜，近年来一些研究表明血清G17还有促进增殖和抑制凋亡的作用。血清G17可以提示患者胃黏膜的功能状态，因此在胃肠疾病的诊断中具有重要意义。在慢性萎缩性胃炎(chronicatrophicgastritis，CAG)中，血清G17与胃黏膜萎缩部位及萎缩程度具有相关性。在一项病例对照研究中发现胃窦萎缩组的血清G17比对照组低，胃体萎缩组的血清G17比对照组高，多灶性萎缩组的血清G17比对照组低，但高于胃窦组。分析其原因可能为胃窦萎缩时，G细胞数量较少，G17合成降低；胃体萎缩时，泌酸细胞数量减少，胃内处于低酸状态，由胃泌素胃酸轴负反馈导致胃泌素升高。将胃黏膜轻、中和重度萎缩组分别与正常对照组比较，血清G17含量在胃黏膜轻度萎缩时显著增高，中度萎缩时无显著差异，重度萎缩时显著降低；与正常对照组比较，G细胞数量在胃黏膜轻度萎缩时无显著差异。而在胃黏膜中、重度萎缩时则显著降低。研究发现在所有患者中，与非萎缩性胃炎组相比，胃溃疡组血清G17水平显著升高(P<0.05)。通过对3906份血清样品的G17水平检测发现，由正常者经浅表性胃炎至胃糜烂或溃疡，血清G17水平进行性升高。血清G17水平升高可能与胃黏膜存在炎症反应以及胃糜烂溃疡患者多伴有H.pylori感染相关。血清G17能够反映胃黏膜的功能状态。在慢性胃炎、胃溃疡中，血清G17均有相应改变，此为临床医师在胃肠疾病的诊断中提供了重要的血清学依据。免疫分析技术是利用微量抗原与相应的高特异性抗体之间的免疫反应，来检测如激素、药物、蛋白质、多肽、酶、肿瘤相关抗原、微生素、病毒、细菌及金属元素等生物体内活性物质。免疫分析技术包括标记免疫分析、非标记免疫分析和仪器免疫分析。本试剂盒利用的含有稀土元素的羧基乳胶微球标记免疫分析技术是属于标记免疫分析之一种。荧光免疫分析(FIA)和放射免疫分析(RIA)自问世以来，经历了几十年的发展，但是人们越来越感觉到FIA因自然本地太高，干扰检测结果；RIA采用同位素标记，对人体有极大危害并给实验带来不便。酶免疫分析(EIA)也因酶本身不稳定，受其他影响因素较大，推广应用受到限制。80年代初，人们开始研究用稀土元素代替荧光物质和同位素标记蛋白质或抗体，将时间分辨技术引入到生物检测领域，建立了新型的超微量时间分辨荧光免疫分析技术(TimeresolvedFluoroimmunoassay，简称TrFIA)。该技术采用多学科先进技术，集结了其他免疫分析的特点，在免疫学、分子生物学、细胞学和医学等领域，取得长足的发展和广泛应用。TrFIA利用了具有独特荧光特性的3价稀土离子及螯合物为示踪物代替荧光物质、酶、同位素、化学发光物质，标记抗体、抗原、激素、多肽、蛋白质、核酸探针及生物细胞，待反应体系(如抗原抗体反应、核酸探针杂交、生物素亲和素反应以及靶细胞对效应细胞的杀伤效应等)发生后，用TrFIA检测仪测定反应产物中的荧光强度。根据产物荧光强度和相对荧光强度的比值，判断反应体系中分析物的浓度，从而达到定量分析。在通常的荧光测定中，由于测试样品中含有多种荧光成分，背景荧光(来自样品中的胶体颗粒和溶剂分子引起的散射光以及血清中蛋白质和其他化合物发出的非特异性荧光)强度大、干扰强，成为荧光分析法大范围推广的瓶颈。TrFIA之所以能够成为继EIA、RIA之后一种新的灵敏的检测方法，主要取决于镧系元素独特的荧光特点、检测中采用的波长分辨和时间延迟技术以及解离-增强技术。镧系元素(lanthanide,Ln)属于稀土元素，共有17中，常用于TrFIA主要有铕(Eu)、钐(Sm)、铽(Tb)、镝(Dy)。镧系元素具有独特的荧光发光特点，与普通荧光相比，镧系离子螯合物荧光衰变时间长，为传统荧光的103-106倍。如镧系离子螯合物的荧光衰变时间在60-900μs，常用的Eu3+荧光衰变时间为714μs，普通荧光免疫分析中荧光团的荧光衰变时间只有1-100μs，样品中一些蛋白质的荧光衰变时间仅为1-10μs，因此利用时间分辨技术，延迟一定时间后测量，便可获得Eu3+特异性荧光信号。同时由于衰变时间长，Eu3+标记物在测量时间里可以反复被激发，每次激发后由激发态很快跃迁到基态，就有荧光发出，然后又可被重新激发，如此每秒可有1000次激发，使得TrFIA荧光标记物的相对比活性很高。镧系元素荧光光谱的最大特征是激发光与发射光之间的Stokes位移较大，Eu3+激发波长为337nm，发射波长为615nm，Stokes位移可达278nm；同时Eu3+被激发的荧光光带极窄，荧光的发射峰非常尖锐，可使仪器调整在极窄的波长范围内测定，这样就几乎完全消除了背景荧光的干扰，继而通过时间延迟和波长分辨，将强特异性荧光和背景荧光辨开(故称为时间分辨)，使干扰达到几乎为零。鉴于以上标记方法及检测技术的应用，本试剂盒具有良好的检测特异性、较高的灵敏度、操作的简便性以及稳定的荧光标记物保证了检测的准确性。
技术实现思路
：本专利技术针对现有技术中存在的缺点和不足，提出了一种利用荧光免疫层析的灵敏性，结合荧光免疫层析分析仪实现的灵敏度高、快捷简便，可以准确定量的胃泌素17检测试剂盒及制备方法。本专利技术可以通过以下措施达到：一种胃泌素17检测试剂盒，设有试纸卡，其特征在于所述试纸卡由下至上依次设有：PVC板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其中结合垫上吸附有稀土荧光微球标记的胃泌素17单克隆抗体，所述稀土荧光微球的直径为60-120nm，稀土荧光微球掺杂稀土镧系元素，在基态下稳定，在340-380nm的激发光源作用下发射出波长范围在540-600nm的荧光；所述单克隆抗体为纯化后混合的单克隆抗体，来源于针对2-6个不同的胃泌素17抗原表位的单克隆抗体细胞株。本专利技术所述结合垫的稀土荧光微球的直径优选是90-110nm；所述稀土荧光微球优选掺杂有稀土镧系元素，为铕(Eu)、钐(Sm)、铒(Er)、钕(Nd)等镧系元素的任意一种或几种的混合物；所述稀土荧光微球优选掺杂稀土络合物；结合垫上稀土荧光微球标记的抗体优选来源于针对3个不同抗原表位的单克隆细胞细胞株。本专利技术所述结合垫采用如下步骤制得：将玻璃纤维膜浸泡于200mMTris-HCL处理液中(含1.5％TritonX-100，1.5％BSA，pH7.5)，4℃浸泡4小时，然后取出37℃烘箱烘干4小时，备用，将玻璃纤维膜在Bio-DotXYZ3050三维喷点平台上，用Bio-JetQuanti300非接触式微定量喷头将稀土荧光微球标记的胃泌素17单克隆抗体喷到玻璃纤维膜，37℃烘干2小时后制得。本专利技术中结合垫上的所述稀土荧光微球标记的胃泌素17单克隆抗体采用如下步骤制得：步骤1：单克隆抗体细胞株的获得：参照胃泌素17氨基酸序列本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种胃泌素17检测试剂盒，设有试纸卡，其特征在于所述试纸卡设有由下自上依次设有：PVC板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其中结合垫上吸附有稀土荧光微球标记的胃泌素17单克隆抗体，所述稀土荧光微球的直径为60‑120nm，稀土荧光微球掺杂稀土镧系元素，在基态下稳定，在340‑380nm的激发光源作用下发射出波长范围在540‑600nm的荧光；所述单克隆抗体为纯化后混合的单克隆抗体，来源于针对2‑6个不同的胃泌素17抗原表位的单克隆抗体细胞株。

【技术特征摘要】
1.一种胃泌素17检测试剂盒，设有试纸卡，其特征在于所述试纸卡设有由下自上依次设有：PVC板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其中结合垫上吸附有稀土荧光微球标记的胃泌素17单克隆抗体，所述稀土荧光微球的直径为60-120nm，稀土荧光微球掺杂稀土镧系元素，在基态下稳定，在340-380nm的激发光源作用下发射出波长范围在540-600nm的荧光；所述单克隆抗体为纯化后混合的单克隆抗体，来源于针对2-6个不同的胃泌素17抗原表位的单克隆抗体细胞株。2.根据权利要求1所述的一种胃泌素17检测试剂盒，其特征在于所述结合垫的稀土荧光微球的直径优选是90-110nm；所述稀土荧光微球掺杂有稀土镧系元素。3.根据权利要求2所述的一种胃泌素17检测试剂盒，其特征在于所述稀土荧光微球掺杂稀土络合物；结合垫上稀土荧光微球标记的抗体来源于针对3个不同抗原表位的单克隆细胞细胞株。4.根据权利要求1所述的一种胃泌素17质检测试剂盒，其特征在于所述结合垫采用如下步骤制得：将玻璃纤维膜浸泡于200mMTris-HCL处理液中，4℃浸泡4小时，然后取出37℃烘箱烘干4小时，备用，将玻璃纤维膜在Bio-DotXYZ3050三维喷点平台上，用Bio-JetQuanti300非接触式微定量喷头将稀土荧光微球标记的胃泌素17单克隆抗体喷到玻璃纤维膜，37℃烘干2小时后制得。5.根据权利要求4所述的一种胃泌素17质检测试剂盒，其特征在于结合垫上的所述稀土荧光微球标记的胃泌素17单克隆抗体采用如下步骤制得：步骤1：单克隆抗体细胞株的获得：参照胃泌素17氨基酸序列，选择抗原性强的位点人工合成20个氨基酸左右的多肽序列，交联到KLH上，采用标准的单克隆抗体制备方法制备特异性高亲和力的单克隆抗体细胞株，将所获得的细胞株对应的单克隆抗体进行配对实验和亲和力测定实验，根据实验结果确定捕获抗体和检测抗体；步骤2：单克隆抗体的制备：采用标准的腹水生产工艺制备并纯化用...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪玉婷，陈萍萍，李冠臻，张培镇，孙宁宁，
申请(专利权)人：威海纽普生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37