芘降解功能植物内生细菌PRd5及其应用制造技术

本发明专利技术公开了芘降解功能植物内生细菌PRd5，其分类命名为肠杆菌（

【技术实现步骤摘要】
芘降解功能植物内生细菌PRd5及其应用
本专利技术属于污染环境微生物修复领域，具体涉及了一株芘降解功能植物内生细菌PRd5及其应用。
技术介绍
植物可以从大气、水和土壤中积累对身体健康有害的多环芳烃污染物，并通过食物链富集到人体内，危及人类健康。因此，亟需解决PAHs在农作物体内的积累，保障农产品安全和人类健康。芘作为PAHs中四环污染物的典型代表，由于其环境持久性以及毒性，常被用作测定环境中PAHs污染的指示物和PAHs生物降解的模型分子。植物内生细菌是一类能定殖于植物健康组织间隙或细胞内，不受外部环境影响，能与宿主植物和谐共生的一类微生物。本实验筛选的功能内生细菌不仅可以调控植物对污染物的吸收同时可以提高植物降解有机污染物的能力。
技术实现思路
专利技术目的：本专利技术所要解决的技术问题是提供一株高效芘降解功能植物内生细菌PRd5以及确定其定殖方法和定殖数量。本专利技术还要解决的技术问题是提供了上述芘降解功能植物内生细菌PRd5的筛选方法。本专利技术还要解决的技术问题是提供了芘降解功能植物内生细菌PRd5在降低芘污染中的应用。本专利技术还要解决的技术问题是提供了芘降解功能植物内生细菌PRd5在降低农作物中芘污染的应用，具体是定殖于植物体内以降低植物和种植环境中的芘污染。技术方案：为了解决上述技术问题，本专利技术所采用的技术方案为：芘降解功能植物内生细菌PRd5，其分类命名为肠杆菌属(Enterobactersp.)，保藏编号为CGMCCNo.13218，该菌株已于2016年10月31日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号(中国科学院微生物研究所)，邮编：100101。本专利技术芘降解功能植物内生细菌PRd5的分离过程为：采集江苏省南京市的扬子石化芳烃厂排污口生长良好的植物体，先将植物表面消毒，研磨液稀释涂布于芘无机盐固体培养基上分离纯化出菌株；挑选有明显降解圈且长势旺盛的菌株对其芘降解能力进行测定，最终筛选出芘降解功能植物内生细菌PRd5。一株芘降解功能植物内生细菌PRd5的筛选方法，包括以下步骤：将采集的植物样品清洗干净后置于无菌操作台内依次用75％乙醇水溶液漂洗3～5min，再用无菌水冲洗3～4次，0.1％NaClO漂洗2～5min，再用无菌水冲洗至确保植物表面消毒剂被洗干净。将消毒好的植物样品移入LB固体平板中30℃培养72h，检查植物表面是否存在残留的细菌。剪碎消毒好的植物样品，放进含有适量无菌水的灭菌研钵中充分研磨，静置20min，吸取研磨液的上清稀释涂布于制备好的芘无机盐固体培养基上，30℃培养48h，挑取不同形态的、生长良好的单菌落反复划线，纯化分离菌株。挑选有明显降解圈且长势旺盛的菌株对其芘降解能力进行测定，最终筛选出芘降解功能植物内生细菌PRd5。上述芘降解功能植物内生细菌PRd5通过芘无机盐固体培养基筛选获得。其中，上述芘无机盐培养基包含以下成分：(NH4)2SO4、K2HPO4·3H2O、KH2PO4、NaCl、MgSO4·7H2O、微量元素溶液，pH7.0～7.2，芘含量为50～100mg·L-1。其中，上述微量元素溶液包含以下成分：CoCl2·6H2O、MnCl2·4H2O、ZnCl2、NiCl2·6H2O、CuSO4·5H2O、Na2MoO4·2H2O、Na2SeO4·2H2O。作为优选，上述芘无机盐固体培养基具体由以下成分组成：(NH4)2SO41.50g，K2HPO4·3H2O1.91g，KH2PO40.50g，NaCl0.50g，MgSO4·7H2O0.20g，微量元素溶液2mL，蒸馏水定容至1000mL，pH7.0～7.2。液体培养基中加入1.5％～2％的琼脂后121℃高压灭菌20min，待培养基冷却至50℃～60℃加入适量的芘丙酮溶液，使培养基中芘的终浓度为50mg·L-1。作为优选，上述微量元素溶液具体由以下成分组成：CoCl2·6H2O0.1g，MnCl2·4H2O0.425g，ZnCl20.05g，NiCl2·6H2O0.01g，CuSO4·5H2O0.015g，Na2MoO4·2H2O0.01g，Na2SeO4·2H2O0.01g，蒸馏水定容至1000mL。其中，上述LB培养基由以下成分组成：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl10g，蒸馏水定容至1000mL，pH7.0～7.2。其中，上述芘降解功能植物内生细菌PRd5芘降解率的测定方法，芘降解培养基制作步骤为：5mg·mL-1的芘丙酮溶液过0.22μm滤膜除菌，取一定量置于灭菌的三角瓶中，待丙酮挥发完，加入已灭菌的无机盐培养液，使芘的最终浓度达到50mg·L-1。其中，上述芘降解功能植物内生细菌PRd5芘降解率的测定方法，培养基中芘含量的测定包括以下步骤：培养体系中加入等体积色谱甲醇，30min超声萃取混匀，静置后过0.22μm滤膜，用岛津高效液相色谱测定芘浓度。高效液相色谱设定参数为：InertsilODS-SP-C18反相色谱柱(150mm×4.6mm,5μm)，流动相甲醇：水＝90:10，流速1.0mL·min-1，柱温40℃，检测波长245nm，进样量20μL。本
技术实现思路
还包括添加了基础代谢物质葡萄糖后，芘降解功能植物内生细菌PRd5对50mg·L-1芘的降解动力学曲线。本
技术实现思路
还包括芘降解功能植物内生细菌PRd5在降低芘污染中的应用。上述的应用指的是芘降解功能植物内生细菌PRd5定殖于植物中以降低植物体内与种植环境中的芘污染的应用。上述的应用指的是所述的芘降解功能植物内生细菌PRd5通过浸种和/或灌根+涂叶的定殖方法定殖于植物中以降低植物体内与种植环境中的芘污染的应用。本专利技术通过利用浸种和/或灌根+涂叶等定殖方式将抗性标记过的芘降解功能植物内生细菌PRd5通定殖于以空心菜或上海青等为代表的农作物体内以降低植物和种植环境中的芘污染。本专利技术的植物不仅限于上述的空心菜或上海青等植物，本专利技术可以用于其他植物中芘含量的降解。其中，本专利技术对定殖数量的研究中利用了菌株的抗性标记。抗性平板的制作步骤为：将LB液体培养基或无机盐液体培养基中加入1.5％～2％的琼脂后121℃高压灭菌20min，待培养基冷却至50℃～60℃加入适量的抗生素溶液，使抗生素的最终浓度达到试验的目标浓度(10～150mg·L-1)。其中，上述的浸种定殖方法为农作物种子经表面消毒、催芽、育苗48h后，用OD600nm＝1.0(约为8.77lgCFU·mL-1)的抗性菌株PRd5菌悬液浸泡6h。经对功能菌抗性标记后证实，芘降解功能植物内生细菌PRd5可定殖于作物体内。其中，上述的灌根+涂叶定殖方法为农作物种子经表面消毒、催芽、育苗48h后播种于土壤中，培养至长出第一、二片真叶时，取OD600nm＝1.0(约为8.77lgCFU·mL-1)的抗性菌株PRd5菌悬液浇灌于各植物根部土壤，并将菌悬液涂抹叶片。经对功能菌抗性标记后证实，芘降解功能植物内生细菌PRd5可定殖于作物体内。有益效果：芘降解功能植物内生细菌PRd5在基础代谢基质存在条件下，对芘有较高的降解能力，并可通过浸种或者灌根+涂叶方式定殖到植物体内，促进植物生长同时降低植物体内和环境中的芘污染，芘污染浓度可达50～100mg·kg-1，确保农产品本文档来自技高网...

【技术保护点】
芘降解功能植物内生细菌PRd5，其特征在于，其分类命名为肠杆菌（

【技术特征摘要】
1.芘降解功能植物内生细菌PRd5，其特征在于，其分类命名为肠杆菌（Enterobactersp.），保藏编号为CGMCCNo.13218，该菌株已于2016年10月31日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心。2.根据权利要求1所述的芘降解功能植物内生细菌PRd5，其特征在于，所述芘降解功能植物内生细菌PRd5通过芘无机盐培养基从植物体内筛选获得。3.根据权利要求2所述的芘降解功能植物内生细菌PRd5，其特征在于，所述芘无机盐培养基包含以下成分：(NH4)2SO4、K2HPO4·3H2O、KH2PO4、NaCl、MgSO4·7H2O、微量元素溶液，pH7.0~7.2，芘含量为50~100mg·L-1。4....

【专利技术属性】
技术研发人员：朱雪竹，陶佳雨，刘文韬，苗雅慧，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32