从新的融合蛋白制造重组胰岛素的方法技术

本发明专利技术公开了编码下式（Ⅰ）所示融合蛋白的ＤＮＡ以及采用含有该ＤＮＡ的表达体系生产胰岛素的方法，所述融合蛋白含有：用于蛋白质的表达和分泌的包含至少一个氨基酸残基的引导肽序列［Ｙ］、被用来酶切或者化学裂解的氨基酸序列［Ｘ１］、胰岛素Ｂ链的氨基酸序列［Ｂ－链］、被用来酶切的氨基酸序列［Ｘ２］、具有至少一个氨基酸残基的连接序列［连接物］、被用来酶切的氨基酸序列［Ｘ３］以及胰岛素Ａ链的氨基酸序列［Ａ－链］并且他们的连接顺序为［Ｙ］－［Ｘ１］－［Ｂ－链］－［Ｘ２］－［连接物］－［Ｘ３］－［Ａ－链］（式Ⅰ）。因此提供了可高生产率地生产基因重组胰岛素的方法。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及编码新的融合蛋白的DNA，所述融合蛋白被用来制备重组胰岛素。更具体地讲，本专利技术涉及利用所述DNA从所述融合蛋白制备胰岛素，通过DNA的表达以及凝血酶和羧肽酶B的作用来制备胰岛素。
技术介绍
胰岛素是摄取食物时胰脏中从胰岛的B细胞里分泌出来的是一种储藏和利用糖类、氨基酸、脂肪酸等保持血糖值正常的最重要的激素。血糖为血液中葡萄糖，是生物体中不可缺少的能源。血糖值紊乱时，生物体会表现出严重异常。血糖值高时，发生尿糖，从而导致葡萄糖损失，也就是常说的患了糖尿病。这种状态持续下去，生物体的部分组织会出现并发症。另外，血糖值低下时，能量来源供应不上，生命就会出现危险。血糖值由促血糖上升的促进因子(葡萄糖原、生长激素、氢化可的松、儿茶酚胺)以及降糖因子互作而保持恒定。胰岛素为唯一能够降低血糖值的激素。因此，不论什么原因只要导致胰岛素的分泌降低、胰岛素不够体内所需时，就会患胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)。治疗这样的患者，胰岛素是必须的医药品。人类的胰岛素由21个氨基酸连接而成的A链和30个氨基酸连接而成的B链构成的多肽，A链内有1个二硫键，A和B链之间由两个二硫键连接。胰岛素为在胰脏中胰岛的B细胞的核糖体上最初作为前胰岛素原合成出来。前胰岛素原是含有由24个氨基酸组成的信号肽链(SP)、B链(B)、31个氨基酸组成的C肽链以及A链(A)按照以“SP-B-C-A”这个顺序直线排列的分子。当前胰岛素原进入内质网时，信号肽链被切掉，成为胰岛素原(B-C-A)。胰岛素原在内质网内形成二硫键。形成三维结构之后，激素原转化酶PC1/3将胰岛素原在B-C结合位点切断，然后转化酶PC2又将C-A结合位点切断。最后，当用PC1/3酶切时仍保留在B链的C末端，即，C肽上的N末端的2个碱性氨基酸被羧肽酶H剪切后成为胰岛素。历史上，治疗用胰岛素的生产法的开发是采用从牛或猪等动物的胰脏的抽提物发展起来的。但是和人类的胰岛素组成相比，牛胰岛素的A链中有两个、B链中有一个氨基酸和人类的不同；猪胰岛素的B链中有一个氨基酸和人类的不相同，用牛或猪胰岛素进行治疗时无法避免过敏之类的副作用。后来又开发出通过胰蛋白酶处理猪胰岛素的利用转肽基反应的人类胰岛素的半合成方法。然而通过基因重组技术生产出的基因重组胰岛素，因具有价格低和效率高的特点而成为主流产品。基因重组胰岛素的制造方法开发出许多种。例如，Eli Lilly公司专利技术的方法是已知的，该方法用大肠杆菌分别表达A链和B链，在体外将A链和B链混合，形成二硫键将A链和B链连接(JP-B-18960号公报)，然而，该方法生产效率并不高。之后，该公司又开发出一种改进的方法，包括表达胰岛素原，并在体外形成二硫键连接之后，再用胰蛋白酶和羧肽酶B将C肽链从产物中切除而制成胰岛素(JP-B-1-48278号公报，日本专利第2634176号)。Novo Nordisk公司开发出了另一种方法，该方法包括利用酵母表达含有通过两个碱性氨基酸残基连接起来的A链和B链的微型胰岛素原，然后在体外用胰蛋白酶处理该微型胰岛素原获得胰岛素(JP-B-7-121226号公报，JP-B-8-8871号公报，专利第2553326号公报)。这种方法具有优点，即，在微型胰岛素原表达和分泌的过程中二硫键形成，并且因微型胰岛素原分泌到培养基中而容易将其分离和纯化。重组胰岛素的新制法一直被不断地开发着。Hoechst公司开发了一种方法，该方法包括用大肠杆菌表达新型的胰岛素衍生物或前胰岛素原，在体外形成二硫键连接，然后用赖氨酰内肽酶或梭菌蛋白酶(clostripain)/羧肽酶B处理从而获得胰岛素。(JP-A-2-195896号公报，JP-A-2-225498号公报，JP-A-2-233698号公报，JP-A-3-169895号公报，JP-A-4-258296号公报，JP-A-6-228191号公报，和JP-A-7-265092号公报)。最近，Bio-technology General Corp.开发出了一种方法，用大肠杆菌表达过氧化物歧化酶(SOD与胰岛素原连接的融合蛋白，以提高两种蛋白的表达效率和二硫键的形成效率，通过胰蛋白酶和羧肽酶B将胰岛素原转化为胰岛素(WO96/20724)。因此，有许多制备重组胰岛素的途径，而且在表达效率、二硫键的形成效率以及胰岛素转化方面等等有了不少改进。生产重组蛋白质的宿主具有很宽的范围，包括微生物、动物和植物等等，其中微生物是最常使用的，因为他们容易操纵、可良好地应用于工业生产，并且大肠杆菌和酵母是特别为人们所熟知的。近年来，枯草杆菌属中的短杆菌(Bacillus brevis)表达系统也被用来制备重组蛋白(参见，日本专利第2082727号；JP-A-62-201583号公报；Yamagata，H等在细菌学报(Journal of Bacteriology)(1987)1691239-1245；鹈高重三，日本农艺化学会杂志(1987)61669-676；Takao，M.等人应用微生物学及生物技术(Appl.Microbiol.Biotechnol.)(1989)3075-80；Yamagata，H等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1989，863589-3593)。本专利技术的目的是开发出一种具有等同于或高于现有重组胰岛素生产方法的产量和生产效率的胰岛素表达系统以及生产方法，换句话说，本专利技术的目的在于开发出一种将胰岛素前体转换成胰岛素的新方法、一种胰岛素活性所必须的二硫键可形成的环境以及一种产量高的表达系统。专利技术的概述本专利技术的一个方面提供编码下式(I)所示融合蛋白序列的DNA------ (式I)其中Y是用于蛋白质的表达和分泌的包含至少一个氨基酸残基的引导肽序列，X1是可酶切或者化学裂解的氨基酸序列，B-链是胰岛素B链的氨基酸序列，X2是可酶切的氨基酸序列，连接物是具有至少一个氨基酸残基的连接序列，X3是可酶切的氨基酸序列，以及A-链是胰岛素A链的氨基酸序列，并且Y、X1、B-链、X2、连接物、X3和A-链按照式I所示的顺序连接。本专利技术的另一方面提供编码下式(II)所示融合蛋白序列的DNA---- (式II)其中B-链是胰岛素B链的氨基酸序列，X2是可酶切的氨基酸序列，连接物是具有至少一个氨基酸残基的连接序列，X3是可酶切的氨基酸序列，以及A-链是胰岛素A链的氨基酸序列，并且B-链、X2、连接物、X3和A-链按照式II所示的顺序连接。在本专利技术的一个实施方案中，用于酶切融合蛋白的氨基酸序列X1、X2或X3可被凝血酶切断。比如，能被凝血酶切断的氨基酸序列为X1＝GlySerLeuGlnProArg(SEQ ID NO1)X2＝ArgGlyHisArgPro (SEQ ID NO2)或X3＝ProArg。在本专利技术的其他实施方案中，连接物的氨基酸序列为GluAlaGluAspLeuGlnValGlyGlnValGluLeuGlyGlyGlyProGlyAlaGlySerLeuGlnProLeuAlaLeuGluGlySerLeuGln (SEQ ID NO3)在本专利技术的进一步的实施方案中，引导肽序列可包括来自芽孢杆菌属的细菌的作为细胞壁蛋白(CWP)之一的MWP蛋白的N末本文档来自技高网...

【技术保护点】
编码下式（Ⅰ）所示融合蛋白的ＤＮＡ：［Ｙ］－［Ｘ１］－［Ｂ－链］－［Ｘ２］－［连接物］－［Ｘ３］－［Ａ－链］（式Ⅰ）其中Ｙ是用于蛋白质的表达和分泌的包含至少一个氨基酸残基的引导肽序列，Ｘ１是可酶切或者化学裂解的氨基酸序列，Ｂ－链是胰岛素Ｂ链的氨基酸序列，Ｘ２是可酶切的氨基酸序列，连接物是具有至少一个氨基酸残基的连接序列，Ｘ３是可酶切的氨基酸序列，以及Ａ－链是胰岛素Ａ链的氨基酸序列，并且Ｙ、Ｘ１、Ｂ－链、Ｘ２、连接物、Ｘ３和Ａ－链按照式Ⅰ所示的顺序连接。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：冈周作，佐藤静治，东久迩真彦，近藤雅昭，工藤季之，渡边重明，胁能宏，结城宽孝，
申请(专利权)人：伊藤火腿株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]