LH-RH衍生物的制备方法技术

本发明专利技术涉及生产ＬＨ－ＲＨ衍生物的方法，其特征在于在胰凝乳蛋白酶或胰凝乳蛋白酶样酶存在下，使通式（１）所示的肽片段＄ｐＧｌｕ－Ｈｉｓ－Ｔｒｐ－ＯＲ＃＋［１］（１）（其中Ｒ＃＋［１］代表低级烷基）＄和通式（２）所示的另一肽片段＄Ｈ－Ｓｅｒ－Ｔｙｒ－Ｘ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－Ｐｒｏ－Ｙ（２）＄（其中Ｘ代表选自Ｄ－Ｌｅｕ、Ｄ－Ｓｅｒ（Ｂｕｔ）、Ｄ－Ｔｒｐ、（２－萘基）－Ｄ－Ａｌａ和Ｇｌｙ的Ｄ－氨基酸；Ｙ代表Ｇｌｙ－ＮＨ＃－［２］、　ＡＺｇｌｙ（氮杂甘氨酸）－ＮＨ＃－［２］或ＮＨＲ＃＋［２］（其中Ｒ＃＋［２］是低级烷基））＄进行反应，产生通式（３）所示的ＬＨ－ＲＨ衍生物＄ｐＧｌｕ－Ｈｉｓ－Ｔｒｐ－Ｓｅｒ－Ｔｙｒ－Ｘ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－Ｐｒｏ－Ｙ（３）＄（其中Ｘ和Ｙ如上所定义）。＄由于此方法没有伴随副反应如外消旋化，使得ＬＨ－ＲＨ衍生物易于分离和纯化。此外，该方法可获得高收率，以及回收和循环可使用未反应的肽片段，因此，在工业使用是有价值的。（*该技术在2017年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及有效生产LH-RH衍生物的酶学方法，一种能用作药物的肽。
技术介绍
黄体生成素(LH)和卵泡刺激素(FSH)是由垂体前叶释放出来的，受控于下丘脑产生的LH-RH(促黄体素释放激素)。LH-RH及其衍生物具有促进促性腺激素分泌的活性，按序给药LH-RH及其衍生物可抑制性腺功能，因此它们可用作药物以抑制和/或治疗诸如子宫内膜异位、中枢性早熟、不育和前列腺癌这些疾病。已用作药物的LH-RH及其衍生物包括布舍瑞林(JP-B-60-9519专利公报)、戈舍瑞林(JP-B-61-13480)、亮丙瑞林(JP-B-53-14072)和那法瑞林(JP-B-63-56238)。作为生产上述LH-RH及其衍生物的方法，通过液相合成的化学合成方法是已知的，其中由液相或固相法形成具有相应于多肽的部分序列的肽片段，然后每一肽片段通过液相偶联(JP-B-56-47175，JP-A-49-117468，JP-B-57-29462，JP-B-57-25540，JP-B-63-17839，JP-B-63-45398，JP-A-48-40770，JP-A-50-88069，JP-A-49-41375，JP-A-49-41376，JP-A-48-99170，JP-B-52-20996，JP-A-49-35381，JP-B-52-8831，JP-B-57-61268，JP-B-53-14072，JP-B-57-26506，JP-B-60-22720，JP-B-61-13480和JP-B-3-71439)。然而，在液相合成法中，随着肽中氨基酸残基数目的增加溶解度产生微妙变化，由此使得难以找到合适的溶剂。随着这种难度的增加，从未反应的物质和副产品中分离出所需肽也变得更加困难。尤其是LH-RH及其衍生物的第4位上的Ser残基易被外消旋化，从而作为杂质而残留下来，使得回收原料变得不可能。由于反应后的处理困难且不经济，因此从技术上来讲这种方法是不能令人满意的。专利技术简述本专利技术目的是提供一种可低成本大规模有效生产LH-RH衍生物的方法。为解决上述问题我们进行了深入研究。结果，发现了一种适于工业化生产LH-RH衍生物的酶法合成方法，即我们的专利技术。本专利技术特征在于在选自胰凝乳蛋白酶和胰凝乳蛋白酶样酶中的一种酶存在下，将通式(1)所示的肽片段pGlu-His-Trp-OR1(1)(其中R1代表低级烷基)和通式(2)所示的肽片段H-Ser-Tyr-X-Leu-Arg-Pro-Y (2)(其中X代表选自D-Leu、D-Ser(But)、D-Trp、(2-萘基)-D-Ala和Gly中的氨基酸；Y代表Gly-NH2、Azgly(氮杂甘氨酸)-NH2或NHR2(其中R2是低级烷基))进行反应，产生通式(3)所示的LH-RH衍生物pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-X-Leu-Arg-Pro-Y (3)(其中X和Y如上所定义)。此处，本专利技术特征在于上述R1是具有1至3个碳原子的烷基，R2是具有1至3个碳原子的烷基。本专利技术特征还在于上述选自胰凝乳蛋白酶和胰凝乳蛋白酶样酶中的酶是胰凝乳蛋白酶。另外，本专利技术的特征在于在选自胰凝乳蛋白酶和胰凝乳蛋白酶样酶中的一种酶存在下，将通式(4)所示的肽片段 pGlu-His-Trp-OR1(4)(其中R1代表低级烷基)和通式(5)所示的肽片段H-Ser-Tyr-X-Leu-Arg-Pro-Y (5)(其中X代表选自D-Leu、D-Ser(But)、D-Trp、(2-萘基)-D-Ala和Gly中的氮基酸；Y代表Gly-NH2、Azgly-NH2或NHR2(其中R2是低级烷基))在水或缓冲液与有机溶剂混合成的一种溶剂中反应，产生通式(6)所示的LH-RH衍生物pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-X-Leu-Arg-Pro-Y (6)(其中X和Y如上所定义)。此处，本专利技术的特征在于所述水或缓冲液与有机溶剂混合成的一种溶剂是，其中将水或缓冲液和可与水混溶的有机溶剂混合而得的一种混合物，或者是一种其中水或缓冲液被可与水部分混溶的有机溶剂饱和而得的混合物。另外，本专利技术的特征在于在选自胰凝乳蛋白酶和胰凝乳蛋白酶样酶中的一种固定化酶存在下，将通式(7)所示的肽片段pGlu-His-Trp-OR1(7)(其中R1代表低级烷基)和通式(8)所示的肽片段H-Ser-Tyr-X-Leu-Arg-Pro-Y (8)(其中X代表选自D-Leu、D-Ser(But)、D-Trp、(2-萘基)-D-Ala和Gly中的氨基酸；Y代表Gly-NH2、Azgly-NH2或NHR2(其中R2是低级烷基))在水或缓冲液与有机溶剂混合成一种溶剂中反应，产生通式(9)所示的LH-RH衍生物pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-X-Leu-Arg-Pro-Y (9)(其中X和Y如上所定义)。本说明书中，LH-RH衍生物指下文通式(10)(SEQ.ID.NO1)所示的LH-RH中的第6位或第10位的Gly被一个不同的氨基酸、一个特定氨基酸或修饰氨基酸取代的肽。pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2(10)相应于第6位Gly的氨基酸(下文称为X)可以是普通的D-氨基酸或经修饰的D-氨基酸。例如，这里所说的D-氨基酸可以是D-Leu、D-Trp、D-Ala、D-Phe、D-Val或D-His，而经修饰的氨基酸可以是D-Ser(But)或(2-萘基)-D-Ala。此外，X可以是L-氨基酸。当X是D-氨基酸时，优选D-Leu、D-Trp、D-Ala、D-Ser(But)或(2-萘基)-D-Ala；当X是L-氨基酸时，优选Gly。相应于第10位的Gly的氨基酸(下文称为Y)优选为Gly-NH2、Azgly-NH2或NHR2(其中R2是低级烷基)。这里的“低级烷基”指具有1至3个碳原子的烷基，如甲基、乙基、丙基或异丙基。R1优选甲基或乙基，R2优选乙基或甲基。此外，本说明书中表示氨基酸、肽、保护基、溶剂和其他所用的缩写形式均按照国际纯粹化学和应用化学联合会(IUPAC)和国际生物化学联合会(IUB)的规则或是本专利技术所属领域的常规符号。例子如下所示。除非另有说明，可能的氨基酸光学异构体指L-构型。Tyr酪氨酸残基Gly甘氨酸残基Azgly氮杂甘氨酸残基Glu谷氨酸残基pGlu焦谷氨酸残基Ser丝氨酸残基Arg精氨酸残基Pro脯氨酸残基Leu亮氨酸残基 His组氨酸残基Ala丙氨酸残基Trp色氨酸残基Et乙基Boc叔-丁氧羰基Aoc叔-戊氧羰基Bz苄基Z苄氧羰基Tos甲苯磺酰基OMe甲酯OBz苄酯OSuN-羟基琥珀酰亚胺酯TFA三氟乙酸THF四氢呋喃DMF二甲基甲酰胺DCC二环己基碳二亚胺WSCN-乙基-N’-二甲氨基丙基-碳二亚胺HOSuN-羟基琥珀酰亚胺HOBt1-羟基苯并三唑MeOH甲醇EtOH乙醇AcOH乙酸通式(1)所示的肽片段与通式(3)所示的LH-RH衍生物的氨基酸序列中的第1至3位氨基酸残基一致。并且，通式(2)所示的肽片段与通式(3)所示的LH-RH衍生物的氨基酸序列中的第4至10位氨基酸残基一致。根据熟知的合成肽的方法可以合成通式(1)或通式(2)所示的肽片段。例如，根据Th本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生产ＬＨ－ＲＨ衍生物的方法，其特征在于 在选自胰凝乳蛋白酶和胰凝乳蛋白酶样酶中的一种酶存在下，使通式（１）所示的肽片段 ｐＧｌｕ－Ｈｉｓ－Ｔｒｐ－ＯＲ↑［１］ （１）（其中Ｒ↑［１］代表低级烷基） 和通式（２）所示的肽片段 Ｈ－Ｓｅｒ－Ｔｙｒ－Ｘ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－Ｐｒｏ－Ｙ （２） （其中Ｘ代表选自Ｄ－Ｌｅｕ、Ｄ－Ｓｅｒ（Ｂｕｔ）、Ｄ－Ｔｒｐ、（２－萘基）－Ｄ－Ａｌａ、Ｌｅｕ和Ｇｌｙ中的氨基酸；Ｙ代表Ｇｌｙ－ＮＨ↓［２］、Ａｚｇｌｙ（氮杂甘氨酸）－ＮＨ↓［２］或ＮＨＲ↑［２］（其中Ｒ↑［２］是低级烷基）） 进行反应，产生通式（３）所示的ＬＨ－ＲＨ衍生物 ｐＧｌｕ－Ｈｉｓ－Ｔｒｐ－Ｓｅｒ－Ｔｙｒ－Ｘ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－Ｐｒｏ－Ｙ （３） 其中Ｘ和Ｙ如上所定义。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：樫本和久，长野由美子，大畠章子，
申请(专利权)人：伊藤火腿株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]