用于核酸药物线性DNA含量的检测方法技术

本发明专利技术提出了用于核酸药物线性DNA含量的检测方法，该方法包括：将待测核酸药物进行液相色谱分析，基于液相色谱分析的结果，确定所述待测核酸药物线性DNA的含量。利用根据本发明专利技术实施例的用于核酸药物线性DNA含量的检测方法，可快速、准确、灵敏地对核酸药物中线性质粒DNA进行分离和定量分析，可作为核酸药物(包括中间过程样品、原液、半成品、成品)的常规质控手段，可以为核酸药物的生产提供可靠的质控证据，为重组生物制品的研发和安全生产提供重要支持，进而保证临床用药的安全。

A method for the determination of linear DNA content of nucleic acid drugs

The invention provides a detection method for the linear DNA content of nucleic acid drugs. The method comprises the following steps: liquid chromatographic analysis of the nucleic acid drugs to be tested, and determination of the content of the linear DNA of the nucleic acid drug to be determined based on the results of liquid chromatography analysis. According to the method for detecting nucleic acid drug linear DNA content of the embodiment of the invention can be fast, accurate and sensitive method for separation and quantitative analysis of nucleic acid drugs in linear plasmid DNA, can be used as nucleic acid drugs (including intermediate process, sample solution, semi-finished products and finished products) of the conventional control method, can provide reliable evidence for quality control the nucleic acid drug production, provide important support for the development and safe production of recombinant biological products, and ensure the safety of clinical medication.

【技术实现步骤摘要】
用于核酸药物线性DNA含量的检测方法
本专利技术涉及生物医药领域，具体地，本专利技术涉及用于核酸药物线性DNA含量的检测方法。
技术介绍
细胞内双螺旋DNA分子很长，通常是细胞长度的1000倍至几万倍，所以细胞内的DNA必须要经过折叠和包装。DNA双螺旋轴可进一步弯曲、缠绕成DNA的三级结构--拓扑结构。最常见的三级结构是DNA的超螺旋DNA(SupercoiledCircularDNA，简称SC)、线性DNA(LinearDNA，简称LDNA)和开环DNA(OpenCircularDNA，简称OC)。在细菌细胞内，共价闭环质粒(cccDNA)以超螺旋形式存在。在提取质粒过程中，除了超螺旋DNA外，还会产生其它形式的质粒DNA。如果质粒DNA两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，形成松弛型的环状分子，称开环DNA；如果质粒DNA的两条链在同一处断裂，则形成线状DNA。
技术实现思路
本专利技术是基于专利技术人对以下问题和事实的发现而做出的：专利技术人发现，以质粒为载体的核酸药物，其中，线性DNA的含量是影响核酸药物活性的关键因素，线性DNA的含量越高，核酸药物的活性越低，并且线性DNA存在临床用药的风险，进而，如何快速准确的检测以质粒为载体的核酸药物中线性DNA的含量，是本领域技术人员迫切要解决的问题。在本专利技术的第一方面，本专利技术提出了一种用于核酸药物线性DNA含量的检测方法。根据本专利技术的实施例，所述方法包括：将待测核酸药物进行液相色谱分析，基于液相色谱分析的结果，确定所述待测核酸药物线性DNA的含量，其中，所述液相色谱分析的条件是：流动相A为25mM硼酸，NaOH或KOH溶液调pH9.0，流动相B为25mM硼酸含1MNaCl或KCl，NaOH或KOH溶液调pH9.0，上样量为5μl～10μl，流速为0.5～1.0ml/min，柱温25～40℃，检测波长260nm，采集时间10min，高斜率梯度洗脱，梯度斜率为5％～15％，梯度洗脱程序为：其中，所述线性DNA的含量是通过如下方式确定的：确定线性DNA含量在总DNA含量中的比值，所述比值是通过液相色谱分析所得到线性DNA对应的峰面积与总峰面积的比值确定的；将待测核酸药物的总DNA含量与所述比值相乘，确定所述线性DNA的含量，其中，所述总DNA含量是通过对待测核酸药物进行紫外分光光度检测确定的。利用根据本专利技术实施例的用于核酸药物线性DNA含量的检测方法，可快速(仅需10min)、准确、灵敏地(最低检测限可达30ng/μl)对核酸药物中线性质粒DNA进行分离(主成分超螺旋DNA与线性DNA的分离度达1.5)和定量分析，可作为核酸药物(包括中间过程样品、原液、半成品、成品)的常规质控手段，可以为该药物的生产提供可靠的质控证据，为重组生物制品的研发和安全生产提供重要支持，进而保证临床用药的安全。在本专利技术的第二方面，本专利技术提出了一种用于核酸药物线性DNA含量的检测方法。根据本专利技术的实施例，所述方法包括：将待测核酸药物进行液相色谱分析，基于液相色谱分析的结果，确定所述待测核酸药物线性DNA的含量。利用根据本专利技术实施例的用于核酸药物线性DNA含量的检测方法，可快速、准确、灵敏地对核酸药物中线性质粒DNA进行分离和定量分析，可作为核酸药物(包括中间过程样品、原液、半成品、成品)的常规质控手段，可以为该药物的生产提供可靠的质控证据，为重组生物制品的研发和安全生产提供重要支持，进而保证临床用药的安全。根据本专利技术的实施例，上述用于核酸药物线性DNA含量的检测方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：根据本专利技术的实施例，所述液相色谱分析的流动相A为25mM硼酸，流动相B为25mM硼酸含1MNaCl/KCl。专利技术人通过大量的筛选实验发现，当流动相A采用25mM硼酸，流动相B采用含1MNaCl或KCl的25mM硼酸时，核酸药物中线性DNA和超螺旋DNA分离度高，对核酸药物中线性DNA的定量分析的准确度进一步提高。根据本专利技术的的实施例，所述流动相A和流动相B的pH为9.0。专利技术人发现，所述流动相pH为9.0，能够显著提高流动相的缓冲能力，适于线性DNA与超螺旋DNA的分离与定量。根据本专利技术的实施例,所述流动相A和流动相B的pH是采用NaOH或KOH进行调节的。根据本专利技术的实施例，流动相B采用含有NaCl或KCl的硼酸溶液，进而优选采用对应的碱性溶液NaOH或KOH进行调节pH值，可避免引入其它离子，避免对离子交换色谱分离线性DNA造成干扰，而影响洗脱效果和定量分析。根据本专利技术的实施例，所述液相色谱分析的上样量为5μl～10μl，流速为0.5～1.0ml/min，柱温为25～40℃，检测波长为260nm，采集时间为10min。专利技术人发现，本专利技术实施例的液相色谱分析采用上述上样量、流速、注温、检测波长和采集时间，能够使得核酸药物中线性DNA和超螺旋DNA的分离度大幅提高，对线性DNA定量的准确度进一步提高。根据本专利技术的实施例，所述液相色谱分析采用高斜率梯度洗脱，所述梯度斜率为5％～15％。专利技术人经过大量的实验发现，梯度斜率低于5％，仅适用于开环DNA与超螺旋DNA的分离，而无法实现线性DNA与超螺旋DNA的分离，无法对线性DNA进行定量；梯度斜率高于15％，无法实现线性DNA与超螺旋DNA的完全分离，影响线性DNA的准确定量；采用梯度斜率为5％～15％洗脱程序，可实现线性DNA与超螺旋DNA的完全分离并准确定量。根据本专利技术的实施例，所述液相色谱分析采用的梯度洗脱的程序为：专利技术人经过实验发现，在上述梯度洗脱的条件下，核酸药物中线性DNA和超螺旋DNA的分离度高，可对线性DNA进行准确定量。根据本专利技术的实施例，所述线性DNA的含量是通过如下方式确定的：确定线性DNA含量在总DNA含量中的比值，所述比值是通过液相色谱分析所得到线性DNA对应的峰面积与总峰面积的比值确定的；将待测核酸药物的总DNA含量与所述比值相乘，确定所述线性DNA的含量，其中，所述总DNA含量是通过对待测核酸药物进行紫外分光光度检测确定的。利用根据本专利技术实施例的上述确定线性DNA的含量的方式，可准确定量待测核酸药物中线性DNA的含量。根据本专利技术的实施例，当线性DNA的含量在30ng/微升～480ng/微升时，所述线性DNA的含量是基于下列方程确定的：Y＝0.9692x-44.088，其中，x表示线性DNA的含量，Y表示线性DNA对应的峰面积。专利技术人考察了质粒线性DNA的不同进样量与峰面积的关系，意外地发现质粒线性DNA的不同进样量与峰面积，在线性DNA的含量在30ng/微升～480ng/微升时，存在明显的线性关系，进而当线性DNA的含量在30ng/微升～480ng/微升时，可通过直接检测待测核酸药物中线性DNA对应的峰面积，通过上述方程计算出线性DNA的含量，检测方法更加快捷。附图说明图1是根据本专利技术实施例的质粒图谱；图2是根据本专利技术实施例的酶切后质粒的凝胶电泳图谱；图3是根据本专利技术实施例的未经酶切的质粒核酸药物的凝胶电泳图谱；图4是根据本专利技术实施例的在条件1的色谱条件下，酶切前样品B(即主成分超螺旋DNA)的色谱图；图5是根据本专利技术实施例的在条件1的色谱条件下，酶切后样品A(线性DNA)的色谱图；图6是本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于核酸药物线性DNA含量的检测方法，其特征在于，包括：将待测核酸药物进行液相色谱分析，基于液相色谱分析的结果，确定所述待测核酸药物线性DNA的含量，其中，所述液相色谱分析的条件是：流动相A为25mM硼酸，NaOH或KOH溶液调pH9.0,流动相B为25mM硼酸含1M NaCl或KCl，NaOH或KOH溶液调pH9.0，上样量为5μl～10μl，流速为0.5～1.0ml/min，柱温25～40℃，检测波长260nm，采集时间10min，高斜率梯度洗脱，梯度斜率为5％～15％，梯度洗脱程序：

【技术特征摘要】
1.一种用于核酸药物线性DNA含量的检测方法，其特征在于，包括：将待测核酸药物进行液相色谱分析，基于液相色谱分析的结果，确定所述待测核酸药物线性DNA的含量，其中，所述液相色谱分析的条件是：流动相A为25mM硼酸，NaOH或KOH溶液调pH9.0,流动相B为25mM硼酸含1MNaCl或KCl，NaOH或KOH溶液调pH9.0，上样量为5μl～10μl，流速为0.5～1.0ml/min，柱温25～40℃，检测波长260nm，采集时间10min，高斜率梯度洗脱，梯度斜率为5％～15％，梯度洗脱程序：其中，所述线性DNA的含量是通过如下方式确定的：确定线性DNA含量在总DNA含量中的比值，所述比值是通过液相色谱分析所得到线性DNA对应的峰面积与总峰面积的比值确定的；将待测核酸药物的总DNA含量与所述比值相乘，确定所述线性DNA的含量，其中，所述总DNA含量是通过对待测核酸药物进行紫外分光光度检测确定的。2.一种用于核酸药物线性DNA含量的检测方法，其特征在于，包括：将待测核酸药物进行液相色谱分析，基于液相色谱分析的结果，确定所述待测核酸药物线性DNA的含量。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述液相色谱分析的流动相A为25mM硼酸，流动相B为25mM硼酸含1MNaCl或KCl。4.根据权利要求3所...

【专利技术属性】
技术研发人员：周昌茂，王学海，许勇，马铮，黄璐，马梵辛，肖强，刘哲，
申请(专利权)人：湖北生物医药产业技术研究院有限公司，武汉珂美立德生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42