抗小鼠MXRA7单克隆抗体的制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种抗小鼠MXRA7单克隆抗体的制备方法及其应用，抗体由保藏编号为CCTCC NO:C2017142的杂交瘤细胞株产生，制备方法包括以下步骤：（1）用带有酶切位点的引物扩增MXRA7蛋白质编码基因，并将其克隆到原核表达载体中，经菌体表达纯化融合蛋白质；（2）用纯化的融合蛋白质作为抗原免疫小鼠，制备阳性杂交瘤细胞，将阳性细胞打到小鼠腹腔中获得小鼠腹水，将腹水进行纯化获得单克隆抗体；（3）纯化MXRA7单克隆抗体并验证其特异性。通过本发明专利技术的方法制备的MXRA7蛋白质单克隆抗体效价高、稳定性好、特异性强，可用于免疫学检测，从而为全方位探究MXRA7蛋白质功能提供了可靠便利的研究工具。

Preparation and application of anti mouse MXRA7 monoclonal antibody

The invention discloses a preparation method and application of an anti mouse MXRA7 monoclonal antibody, the antibody from the preservation number of hybridoma cell strain CCTCC NO:C2017142 production, the preparation method comprises the following steps: (1) using primers with restriction site amplified MXRA7 protein encoding gene, and cloned into prokaryotic the bacterial expression vector, expression and purification of fusion protein; (2) with the purified fusion protein as antigen to immunize mice, preparation of hybridoma cells, the positive cells to obtain mouse ascites in mice, the ascites were purified to obtain monoclonal antibody; (3) purification of MXRA7 monoclonal antibody and verify its specificity. The MXRA7 protein monoclonal antibody prepared by the method has high titer, good stability and specificity, and can be used for immunological detection, so as to provide a reliable and convenient research tool for exploring the function of MXRA7 protein in all directions.

【技术实现步骤摘要】
抗小鼠MXRA7单克隆抗体的制备方法及其应用
本专利技术属于生物
，具体涉及抗小鼠基因MXRA7单克隆抗体SZ181、制备方法；还涉及该单克隆抗体在Westernblot、免疫组化及流式细胞术中的应用。
技术介绍
MXRA7是一种位于小鼠第11号染色体上的单拷贝基因，其编码氨基酸的分子量约为20KDa。该基因最初是2002年Walker等通过生物信息学分析时发现有8条cDNA总是跟一组与基质重建相关的基因（主要包括Mmps，Timps等）共同表达，于是将这8条cDNA依次命名为MXRA1～8。目前为止，虽然某些成员已被成功克隆并进行了功能研究，但仍没有关于MXRA7的任何功能性研究报道。本课题组近年来证实该基因具有以下特性：（1）该基因在多种肿瘤组织及正常组织中表达有区别；过表达MXRA7明显抑制小鼠前列腺癌细胞的增殖及肿瘤的发生、转移，提示MXRA7不但可作为肿瘤标记物，本身还可抑制肿瘤的发生发展，可能成为理想的肿瘤靶向治疗分子；（2）该基因敲除后影响组织修复能力；（3）同时该基因与血管新生、免疫重建等有密切关联。因此制备以小鼠MXRA7为靶点的单克隆抗体，对进一步探究MXRA7的生理病理功能有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种抗小鼠MXRA7单克隆抗体SZ181的制备方法，SZ181是根据实验室的抗体库进行的编号，该抗体由Balb/c小鼠的杂交瘤细胞株SP2/0-MXRA7分泌产生，，并证明所述单克隆抗体SZ181可用于检测小鼠各组织内MXRA7蛋白质的表达，为小鼠MXRA7功能研究提供了有用的工具。为了实现上述目的，本专利技术提供以下技术方案：一种抗小鼠MXRA7单克隆抗体的制备方法，由保藏编号为CCTCCNO:C2017142的杂交瘤细胞株分泌产生；所述MXRA7单克隆抗体的制备方法包括以下步骤：（1）以化学合成的MXRA7蛋白质编码基因SEQIDNO.3为模板，使用上游引物SEQIDNO.1和下游引物SEQIDNO.2对模板进行扩增获得两端带有酶切位点的鼠MXRA7蛋白质编码基因，并将其克隆到原核表达载体pCold-SUMO中构建原核重组质粒，再将所述原核重组质粒转化至感受态细胞；（2）将感受态细胞进行培养表达，得到SUMO-MXRA7融合蛋白，并对SUMO-MXRA7融合蛋白进行纯化；（3）将纯化后的SUMO-MXRA7融合蛋白免疫Balb/c小鼠后，测定小鼠血清效价，取其脾脏制备脾细胞悬液；将同系的SP2/0细胞与小鼠脾细胞融合制备SP2/0杂交瘤细胞，筛选并纯化阳性的SP2/0杂交瘤细胞；（4）采用体外细胞培养法培养步骤（3）所述的阳性SP2/0杂交瘤细胞，将该阳性细胞打到小鼠腹腔中获得小鼠腹水，将腹水进行纯化获得鼠单克隆抗体。本专利技术所述的一种抗小鼠MXRA7单克隆抗体的制备方法，所述步骤（1）中上游引物含有扩增出带KpnI酶切位点的片段GGTACC、下游引物含有扩增出带BamHI酶切位点的片段GGATCC，使用上游引物和下游引物对质粒进行PCR扩增完毕后，取5μLPCR产物，进行1.5％的琼脂糖凝胶电泳，将剩余PCR产物利用PCRclean试剂盒进行纯化，将回收产物用KpnI、BamHI进行双酶切，酶切结束后，用1.5％琼脂糖凝胶电泳，并使用DNA凝胶回收试剂盒回收目的片段；使用KpnI、BamHI双酶切系统对表达载体pCold-SUMO进行双酶切，使其成为线性片段，酶切结束后，用1.5％琼脂糖凝胶电泳，并使用DNA凝胶回收试剂盒回收目的片段；使用T4DNA连接酶，将酶切后的MXRA7编码基因与pCold-SUMO质粒的凝胶回收产物在16℃条件下进行连接反应3h，将连接产物转化DH5a感受态，涂板后，次日，挑取单克隆菌落，进行菌落PCR后进行凝胶电泳，筛选出阳性菌落克隆；提取阳性菌落的重组表达质粒，并将其转入BL21(DE3)感受态细胞中进行蛋白表达，纯化后获得SUMO-MXRA7融合蛋白。本专利技术所述的一种抗小鼠MXRA7单克隆抗体的制备方法中，将所述BL21(DE3)感受态细胞接入含浓度为50μg/mLAmp的LB培养液中，37℃过夜培养；吸取50μL过夜培养物接入5mL含浓度为50μg/mLAmp的LB培养液中，37℃200rpm振荡培养至OD600为0.6-0.7；加入异丙基硫代半乳糖苷至终浓度0.5mM，16℃诱导24小时，将菌液进行离心并收集上清液，将收集的上清液用镍柱NTA树脂进行柱层析纯化，得到纯化后的SUMO-MXRA7融合蛋白。本专利技术所述的抗小鼠MXRA7的单克隆抗体SZ181在生物检测中的应用：1、收集小鼠各正常组织，制作石蜡切片，验证所述MXRA7单克隆抗体SZ181对小鼠正常组织中表达的MXRA7蛋白的检测效果。2、提取小鼠各正常组织的总蛋白，并对所提取的总蛋白进行Westernblot试验，验证所述鼠抗鼠MXRA7单克隆抗体SZ181对小鼠各组织中表达的MXRA7蛋白的检测效果。3、收集MXRA7过表达的小鼠肝癌细胞Hepa1-6-MXRA7及对照细胞，利用流式细胞术，验证所述鼠抗鼠MXRA7单克隆抗体SZ181对小鼠肝癌细胞中表达的HCRCN81蛋白的检测效果。实验结果表明，本专利技术所述鼠抗鼠MXRA7单克隆抗体SZ181对小鼠正常组织和细胞中所表达的MXRA7天然蛋白均具有检测作用，可作为进一步研究小鼠MXRA7功能的重要工具。有益效果：本专利技术首次制备了SP2/0-MXRA7杂交瘤细胞，并提供了一种新型鼠抗鼠MXRA7单克隆抗体SZ181，该抗体能够检测小鼠组织中MXRA7蛋白表达的存在与否，并证实该抗体可应用于蛋白免疫印迹、免疫组化和流式细胞术，为全方位探究MXRA7蛋白功能提供了可靠便利的研究工具；同时该抗体还可识别大鼠MXRA7蛋白，为MXRA7蛋白在不同物种间的比较研究提供了可能。生物保藏说明杂交瘤细胞株MXRA7于2017年08月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，保藏编号为CCTCCNO:C2017142。附图说明图1PCR扩增带相应酶切位点的MXRA7目的片段的琼脂糖凝胶电泳图，图中各泳道为：1、Marker，2、PCR产物。图2测序结果比对图。其中A序列表示测序结果序列、B序列表示SEQIDNO.3序列、C序列表示比对结果。图3SUMO-MXRA7融合蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）菌株中的诱导表达及纯化后的SDS-PAGE图，图中各泳道为：1、Marker，2、未诱导表达的纯化液，3、诱导表达的纯化液，4、菌体裂解沉淀，5、菌体裂解上清，6、流穿液，7、BindingBuffer，8、EluteBuffer。图4质谱结果显示纯化后的融合蛋白比对结果为MXRA7蛋白。其中Topscore显示其与MXRA7序列一致。图5抗体效价及特异性检测结果图。图A，ELISA检测SZ181的抗体效价，抗体对应的稀释倍数为1600-102400倍，每二倍比依次稀释，阴性对照为小鼠IgG蛋白。图B，Westernblot检测SZ181的识别特异性。其中泳道1：纯化的SUMO-MXRA7融合蛋白；泳道2：WT小鼠的肝组织蛋白。图C，Westernblot检测SZ181识别位点位于MXR本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗小鼠MXRA7单克隆抗体的制备方法，其特征在于，该抗体由保藏编号为CCTCC NO:C2017142的杂交瘤细胞株分泌产生；所述制备方法包括以下步骤：（1）以化学合成的MXRA7蛋白质编码基因SEQ ID NO.3为模板，使用上游引物SEQ ID NO.1和下游引物SEQ ID NO.2对模板进行扩增获得两端带有酶切位点的鼠MXRA7蛋白质编码基因，并将其克隆到原核表达载体pCold‑SUMO中构建原核重组质粒，再将所述原核重组质粒转化至感受态细胞；（2）将感受态细胞进行培养表达，得到SUMO‑MXRA7融合蛋白，并对SUMO‑MXRA7融合蛋白；（3）将纯化后的SUMO‑MXRA7融合蛋白免疫Balb/c 小鼠后，测定小鼠血清效价，取其脾脏制备脾细胞悬液；将同系的SP2/0细胞与小鼠脾细胞融合制备SP2/0杂交瘤细胞，筛选并纯化阳性的SP2/0杂交瘤细胞；（4）采用体外细胞培养法培养步骤（3）所述的阳性SP2/0杂交瘤细胞，将该阳性细胞打到小鼠腹腔中获得小鼠腹水，将腹水进行纯化获得鼠单克隆抗体。

【技术特征摘要】
1.一种抗小鼠MXRA7单克隆抗体的制备方法，其特征在于，该抗体由保藏编号为CCTCCNO:C2017142的杂交瘤细胞株分泌产生；所述制备方法包括以下步骤：（1）以化学合成的MXRA7蛋白质编码基因SEQIDNO.3为模板，使用上游引物SEQIDNO.1和下游引物SEQIDNO.2对模板进行扩增获得两端带有酶切位点的鼠MXRA7蛋白质编码基因，并将其克隆到原核表达载体pCold-SUMO中构建原核重组质粒，再将所述原核重组质粒转化至感受态细胞；（2）将感受态细胞进行培养表达，得到SUMO-MXRA7融合蛋白，并对SUMO-MXRA7融合蛋白；（3）将纯化后的SUMO-MXRA7融合蛋白免疫Balb/c小鼠后，测定小鼠血清效价，取其脾脏制备脾细胞悬液；将同系的SP2/0细胞与小鼠脾细胞融合制备SP2/0杂交瘤细胞，筛选并纯化阳性的SP2/0杂交瘤细胞；（4）采用体外细胞培养法培养步骤（3）所述的阳性SP2/0杂交瘤细胞，将该阳性细胞打到小鼠腹腔中获得小鼠腹水，将腹水进行纯化获得鼠单克隆抗体。2.根据权利要求1所述的一种抗小鼠MXRA7单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中上游引物含有扩增出带KpnI酶切位点的片段GGTACC、下游引物含有扩增出带BamHI酶切位点的片段GGATCC，使用上游引物和下游引物对质粒进行PCR扩增完毕后，取5μLPCR产物，进行1.5％的琼脂糖凝胶电泳，将剩余PCR产物利用PCRclean...

【专利技术属性】
技术研发人员：王宜强，沈莹，
申请(专利权)人：苏州大学附属第一医院，
类型：发明
国别省市：江苏,32