一种口蹄疫双价多肽疫苗基因合成及高效表达方法技术

本发明专利技术涉及一种合成的Ａ型及Ｏ型口蹄疫双价多肽疫苗的基因序列及合成方法，合成的基因序列为ＳＥＱＩＤＮＯ：１或ＳＥＱＩＤＮＯ：２所示的序列，以及根据这两个序列分别可推导出其编码的氨基酸序列ＳＥＱＩＤＮＯ：３或ＳＥＱＩＤＮＯ：４所示的序列。将该两段基因序列分别与绿色荧光蛋白基因串联，使之成为双价多肽疫苗融合基因。将该两段双价多肽疫苗融合基因分别构建到原核表达载体中，并使该两段融合基因表达为两种双价多肽疫苗蛋白，该两种蛋白的免疫原性测定表明，合成的两段多肽疫苗基因具有较好的免疫原活性。如牲畜经免疫注射后，可预防Ａ型及Ｏ型两种口蹄疫，而且该两段双价多肽疫苗基因可以用于制备检测Ａ型及Ｏ型两种口蹄疫的抗原。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种编码口蹄疫双价多肽疫苗基因的核苷酸序列及其合成方法和包含上述口蹄疫双价多肽疫苗基因核苷酸序列的载体的构建以及高效表达该段核苷酸编码多肽的方法。2.
技术介绍
口蹄疫(foot-and-mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒(Foot andmouth disease virus，FMDV)感染引起的致偶蹄类动物的一种急性、高度接触性、发热性、毁灭性传染病，以流行广、传播快、发病率高而著称(柳纪省，中国兽医科技.1999，29(3)17-20)。由于猪、牛、羊等主要家畜均可感染此病并形成全球规模流行，被联合国粮农组织和国际兽医局(IEO)列为16种A类传染病之首。口蹄疫的危害性很大，可引起大面积牲畜的死亡，严重影响畜牧业生产和动物及其产品的国际贸易，给农业、畜牧业、国民经济造成巨大的损失(江鹏斐，中国农业科学.1999，32(6)93-100)。因此，预防、控制和消灭口蹄疫的发生显得尤为重要。预防口蹄疫，注射口蹄疫疫苗是防治口蹄疫的有效方法。由于口蹄疫有不同的血清免疫类型，各类型之间的疫苗不能提供交叉保护，因此，预防口蹄疫，多采用与当地流行的病毒类型相匹配的口蹄疫疫苗。口蹄疫现已发现有7种血清免疫类型，以及65个以上的亚型。7种类型分别是A、O、C、亚洲1型(Asia 1)和南非I、II、III型，其中以A型及O型口蹄疫最为普遍，我国即以O型及A型为主。如何能提供足够数量，并能有效进行免疫的疫苗，对易感寄主进行综合免疫，是控制和根除这种疾病的主要方法。目前，我国抗口蹄疫病毒疫苗的传统制备方法是采用组织培养法繁殖口蹄疫病毒，即利用鼠肾细胞系(BHK)传代细胞系方法来生产灭活疫苗，还有一种方法是通过各种减毒方法制得弱毒疫苗。这两种疫苗虽然都有较好的免疫能力，但是制备的安全性较差，因为在生产过程中需培养大量病毒，而该种病毒可通过空气传染，生产过程中与病毒接触过的工具或器皿都有散毒的危险。而且传统的灭活疫苗与弱毒疫苗一旦灭活或减毒不完全，在大规模对动物的免疫过程中，可能会导致极少量被免疫动物发病而成为疾病流行的病源中心与媒介(易建中，黄海斌，杨志军，等，复旦学报(自然科学版)，1997，36(5)23-27)。因此，急需改变传统的疫苗制备方法，建立安全有效的疫苗制备新技术体系。研究开发新型安全有效的口蹄疫疫苗，以控制和消灭口蹄疫。利用基因工程技术进行口蹄疫疫苗的研究受到了广泛的重视，目前所进行的疫苗基因研究包括单价、多价合成多肽疫苗基因、亚单位疫苗基因，即以病毒颗粒中的亚单位-VP1蛋白(具有免疫源性)的基因用作疫苗基因序列；还有报道用非结构蛋白基因等。目前研究较多的是合成肽疫苗基因，合成肽是人工合成的类似于天然抗原的小肽，由这种小肽制成的疫苗安全性好；或以多价的合成肽的DNA序列作为目的基因，通过原核表达系统表达疫苗组份。由于这种方法生产疫苗不是由病毒直接制备而成的，不涉及病毒本身，没有感染性，所以不存在未灭活病毒释放的问题，还可避免一些与特异性免疫无关的成分存在。所以可以确保是安全的(杨永钦，王家驹，云南畜牧兽医，1997，127-29；赵凯，邹士平，张震宇，等。中国免疫学杂志，2002，1889-92)。因此，采用安全的合成肽疫苗进行口蹄疫防治，受到国内外学者广泛重视，合成肽类疫苗不仅安全性好，而且生产与运输都很方便。随着对口蹄疫病毒的基因结构及其病毒颗粒空间结构更进一步的认识，发现VP1蛋白是FMDV最主要的抗原蛋白，VP1蛋白功能区包含FMDV的主要抗原位点，特别是在位点1，即VP1蛋白的141-160位氨基酸和200-213位氨基酸残基序列所组成FMDV的主要抗原区，能诱导动物产生中和抗体，是决定各种亚型FMDV免疫原性的主要抗原决定簇片断，(杨永钦，王家驹，云南畜牧兽医，1997，127-29；Dus Santos MJ，Vccine 2002，201141-1147)。所以利用VP1蛋白或其抗原决定簇部份成为FMD新型疫苗研究的主要途径。国外有人发现化学合成的VP1的141-160位氨基酸和200-213位氨基酸的肽段能引起一定的免疫反应(Kleid DG，Science，1981，214(1525)1125-1129)。我国学者对口蹄疫合成肽疫苗也进行了研究，郑兆鑫等(郑兆鑫，贺沛富，严维耀，等，病毒学报，1989，5(1)41-45)将O型FMDV编码VP1蛋白的141-160位氨基酸和200-213位氨基酸串联为20AA-14AA-20AA类型，并与β-半乳糖甘酶基因相连，在大肠杆菌中表达的融合蛋白，经动物实验证明具有很强的免疫原性，成为安全有效的基因工程疫苗。易建中等(易建中，黄海斌，杨志军，等，复旦学报(自然科学版)，1997，36(5)23-27)将A型FMDV编码VP1蛋白的141-160位氨基酸和200-213位氨基酸串联为20AA-14AA-20AA类型，经斑点ELISA证明，大肠杆菌中表达的融合蛋白，具有A型FMDV抗原活性。然而用O型和A型FMDV编码VP1蛋白研制双价多肽疫苗方面，到目前为止尚未见报道。我国口蹄疫的发生，以O型和A型口蹄疫病毒为主，因此，尽快研制O-A型双价疫苗，用于边界防疫及应急储备，是防治FMD亟待解决的问题(张永光，王永录，等。中国兽医科技.1996，26(5)3-5)。3.
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种编码口蹄疫双价多肽疫苗基因的核苷酸序列及其编码蛋白及该口蹄疫双价多肽疫苗核苷酸序列的合成方法。在对口蹄疫双价多肽疫苗的设计中首先选取来自中国的O型病毒的O58株系的第140-160氨基酸和200-213氨基酸组成的多肽，即O58的20肽、14肽，将其与A型病毒的A62株系第140-160氨基酸和200-213氨基酸组成的多肽，即A62的20肽、14肽，相互串联起来，即成为O58系(20肽-14肽)-A62系(20肽-14肽)串联序列，简称O-A型序列，即为SEQ ID NO1所示的序列。还选取来自中国的A型病毒的A62株系为材料，以其第140-160氨基酸和200-213氨基酸组成的多肽，与O58株系第140-160氨基酸和200-213氨基酸组成的多肽，即O58株系的20肽、14肽，相互串联起来，成为A62(20肽-14肽)-O58(20肽-14肽)串联序列，简称A-O型序列，即为SEQ ID NO2所示的序列。然后再将SEQ ID NO1及SEQ ID NO2所示的基因序列与绿色荧光蛋白基因相连，其表达产物即可用作疫苗。经过设计，分别先合成如下各个序列的片段，然后再进行连接片段AO58株系病毒VP1蛋白的第141-160氨基酸的编码序列。5’gtg acc aaa gtg aga ggc gat ctg cag gtg ctg gcg cag aaa gcg gca cgc tctctg ccg片段BO58株系病毒VP1蛋白的第200-213氨基酸的编码序列5’aga cat aaa cag aag att gtg gca cca ggc aaa cgc ctg ctg片段EA62株系病毒VP1蛋白的第141-160氨基酸的编码序列5’aac gcg ggc cgt cgc ggc gat ctg本文档来自技高网...

【技术保护点】
编码一种口蹄疫双价疫苗的核苷酸序列，其特征在于，该段核苷酸序列由两部分串联构成：一部分是编码口蹄疫Ａ型病毒的第１４０－１６０氨基酸和２００－２１３氨基酸的核苷酸序列，即编码Ａ型病毒的２０肽、１４肽的核苷酸序列相串联起来核苷酸序列；另一部分是编码Ｏ型病毒的第１４０－１６０氨基酸和２００－２１３氨基酸的核苷酸序列，即编码Ｏ型病毒的２０肽、１４肽的核苷酸序列相串联起来核苷酸序列；这两部分核苷酸序列再串联成为Ａ６２（２０肽－１４肽）－Ｏ５８（２０肽－１４肽）或Ｏ５８（２０肽－１４肽）－Ａ６２（２０肽－１４肽）的串联核苷酸序列。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：周长生，陶玲，张勇，陈正华，
申请(专利权)人：甘肃亚盛盐化工业集团有限责任公司，
类型：发明
国别省市：62[中国|甘肃]