重组人内抑素的高效表达方法技术

一种制备重组人内抑素的方法，其特征在于使用含有Ｎ端１位，３－５位氨基酸的编码无意义突变的人内抑素基因的高表达的大肠杆菌工程菌株进行。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程领域。更具体地，本专利技术涉及利用乳糖做为诱导剂诱导重组人内抑素在大肠杆菌工程菌株中高效表达生产重组人内抑素的方法，其中该工程菌株含有如SEQ ID No 3以及图3所示的核苷酸序列；以及上述基因工程方法所生产的重组人内抑素及其在制备用于抗新血管形成，特别是抗肿瘤的药物中的用途；此外，本专利技术还涉及SEQ ID No 3以及图3所示的核苷酸序列在构建高效表达重组人内抑素的大肠杆菌工程菌株中用途；以及乳糖诱导法在诱导重组人内抑素的高效表达中的用途。
技术介绍
内抑素是生物体内胶原18自然降解后C末端183个氨基酸多肽产物，可在生物体液内如血液、尿液中检出。分子量20-24kDa大小。1997年O’Reilly等首先报导发现这一分子，并指出这一分子因具有抑制血管内皮细胞生长的作用，故具有抗新生血管形成功能，也具有明显抑制小鼠移植肿瘤生长的作用。在Boehm等的研究中发现，反复应用纯化后的内抑素分子，不但明显抑制小鼠移植肿瘤的生长，而且无毒副作用，也不产生小鼠的耐药性，这无疑是一治疗肿瘤最有希望的开发药物之一。仅在2年后，美国FDA以历史上最快的速度批准重组人内抑素治疗实体肿瘤的临床实验前，重组人内抑素已在II期临床实验。目前，临床实验中所使用的重组人内抑素为可溶性，由酵母表达产生，由于成本和产量不高的原因，人们还在寻找新的高效表达、低成本、过程简单的途径生产重组人内抑素。1997年，自O’Reilly发现内抑素后，很快将小鼠内抑素基因克隆入原核系统表达载体中，并获得重组小鼠内抑素高效表达，其诱导方法是利用IPTG，表达后的蛋白以包涵体形式存在，但蛋白很难以可溶性形式存在，利用复性再折叠过程处理，可溶性蛋白不足1％。在难以在大肠杆菌中表达出可溶性重组人内抑素后，人们探讨多种形式，多种不同类型的重组人内抑素的表达，有的内抑素获得高表达但不溶或不具备活性，有的具备活性不溶，有的可溶但产量不高。如Boehem等1998年在酵母系统中成功表达可溶性小鼠内抑素，但所获产物具有不均一的N端，分析可能是由于蛋白酶降解的原因，在用B16F10黑色素瘤细胞表达重组的小鼠内抑素，获得均一N端产物，有活性，但产量非常低。1998年SaSaki利用人胚肾细胞表达重组人内抑素可明显抑制小鼠移植肿瘤的生长。在此系统中，所表达的蛋白产量也非常有限。1999年Dhanabal等利用大肠杆菌高效表达出重组小鼠内抑素，但蛋白不溶，所表达出的蛋白有单体，分子量22-25kDa，也有双体分子，分子量在44-46kDa。从所使用的表达系统分析，依然是细菌的表达量为最高，但溶解性是一大难题，许多研究组一直在寻找一个能使细菌表达的重组内抑素可溶的途径，从所获得资料指出，细菌表达重组内抑素大部分以IPTG做为诱导，国内也有采用温控和渗透压改变诱导重组人内抑素表达的报道。因此，本领迫切需要一种既能高效表达，又能使所表达的重组内抑素可溶并且具有人内抑素所固有的活性的生产重组人内抑素的方法。专利技术概述针对上述现有技术中的需要，本专利技术人经过长期的探索和大量的研究，最终成功地专利技术了一种既能高效表达，又能使所表达的重组内抑素可溶并且具有人内抑素所固有的活性的生产重组人内抑素的方法，从而解决了长期困扰本领域技术人员的技术难题本专利技术根据人胶原18C末端编码氨基酸序列的核苷酸合成扩增重组人内抑素的PCR引物，然后利用人胚胎肝细胞mRNA做为模板，经反转录再PCR扩增(RT-PCR)后，获得所期望的扩增片段，经核苷酸序列测定，所获基因与所推断的人内抑素基因序列相符合，为使基因在大肠杆菌中获得高效表达，在不改变氨基酸序列的前提下，设计出N端，细菌偏爱的4个氨基酸编码序列，将突变后的重组人内抑素基因克隆入表达载体pET 24b(Novagen公司.cat No.69418-3)后，经IPTG可诱导产生重组人内抑素的表达，由于表达过程有泄露现象，本专利技术利用葡萄糖控制蛋白表达的泄露，然后利用乳糖诱导蛋白的表达，结果重组人内抑素在细菌中的表达约占菌体蛋白的40％左右，中试放大发酵实验，乳糖可成功诱导重组人内抑素的表达，表达量40％左右，而且经乳糖诱导表达的重组人内抑素蛋白易于溶解、纯化和复性(溶解性很好)，所获蛋白具有明显地抑制内皮细胞生长和动物移植瘤生长的作用。本专利技术的目的之一在于利用乳糖做为诱导剂，诱导重组人内抑素在大肠杆菌中的高效表达；利用乳糖做为诱导剂，在中试和大规模生产中诱导重组人内抑素的高效表达。因此，本专利技术的第一个方面，提供了一种制备重组人内抑素的方法，其特征在于使用含有SEQ ID No.3(附图3)所示的核甘酸的高表达细菌工程菌株进行。优选地，在该方法中，利用乳糖做为诱导剂，诱导重组人内抑素在大肠杆菌中的高效表达。更优选地，在该方法中，利用葡萄糖控制蛋白表达的泄露(leakeage指非诱导性表达)。本专利技术的第二个方面，提供的一种大肠细菌工程菌株，该菌株已经被含有SEQ ID No.3(或者附图3)所示的核甘酸的表达载体转化。该大肠杆菌菌株能高效表达重组人内抑素，而该重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.4(或者附图3)所示。优选地，该大肠细菌工程菌株是于2003年8月6日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，武汉)并且保藏号为CCTCC NOM203063的大肠杆菌BL-21(DE-3)/pENDO工程菌株。本专利技术的第三个方面，提供了一种重组人内抑素，其是由上述方法所生产的，其序列如SEQ ID No.4(或者附图3)所示，易于纯化和复性(溶解性很好，易溶)且与人内抑素具有相同的生物学功能，即具有抑制血管内皮细胞生长的功能，从而对各种因新血管形成所致的疾病有治疗及预防作用。本专利技术的第四个方面，提供了SEQ ID No 3以及图3所示的核苷酸序列。本专利技术的第五个方面，提供了SEQ ID No 3以及图3所示的核苷酸序列在构建高效表达重组人内抑素的大肠杆菌工程菌株中用途。本专利技术的第六个方面，提供了乳糖诱导法在诱导重组人内抑素的高效表达中的用途。本专利技术的第七个方面，提供了上述基因工程方法所生产的重组人内抑素在制备用于抗新血管形成，特别是抗肿瘤的药物中的用途。但是，在以下的“专利技术详述”，尤其是“实施例”部分的公开内容的基础上，本专利技术的其它方面和优点对本领域的普通技术人员来说是显而易见的。附图说明图1人胶原18核苷酸及氨基酸序列(人内抑素(Endostatin)的核酸及氨基酸序列)。图2PCR扩增后所测人内抑素基因序列图，其中图2-15’方向，图2-23’方向。图3突变后人内抑素核苷酸序列及氨基酸序列。图4突变后所测人内抑素基因序列图。图5PCR扩增人内抑素基因琼脂糖凝胶电泳图泳道1标准核苷酸分子量；2、4扩增反应中不含镁离子；3、5扩增反应中含1mM镁离子；650℃扩增含4mM镁离子；758℃扩增含4mM镁离子。图6重组人内抑素基因克隆入pET 24b表达载体图(重组人血管内皮抑制素质粒构建图谱)。图7重组人内抑素在大肠杆菌BL-21(DE3)中IPTG诱导表达泳道1未诱导(含葡萄糖抑制)；2未诱导(不含葡萄糖抑制)；3IPTG诱导2小时；4IPTG诱导3小时；5IPTG诱导4小时。图8重组人内抑素在大肠杆菌BL-21(DE3)中乳糖本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：朱敏生，智刚，朱年春，智强，陈晓明，
申请(专利权)人：广东肇庆星湖生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：