一种高分子量γ聚谷氨酸的发酵方法技术

本发明专利技术属于生物工程发酵技术领域，具体为一种高分子量γ聚谷氨酸的发酵方法。它包括斜面种子培养、二级种子培养和发酵培养的步骤，其特征在于：所述的发酵培养是指将二级种子液按10～15％的体积比例接种到发酵罐的发酵培养基中进行好氧发酵，发酵初始pH设定为6.0～7.0，通过流加5～15％(WT)氢氧化钠溶液控制发酵过程pH 6.0～7.0，发酵至8

【技术实现步骤摘要】
一种高分子量
γ
聚谷氨酸的发酵方法


[0001]本专利技术属于生物工程发酵
，具体为一种高分子量γ聚谷氨酸的发酵方法。

技术介绍

[0002]γ
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聚谷氨酸(γ
‑
PGA)是一种天然存在的水溶性可生物降解的聚合物，由若干个D
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和L
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谷氨酸单体组成，通过α
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氨基和γ
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羧基之间的酰胺键连接，相对分子质量从50KDa到20000KDa不等。γ
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聚谷氨酸主链上存在大量的游离亲水性羧基，在分子内部及分子间形成氢键，因此具有绝佳的保水性能。
[0003]γ
‑
聚谷氨酸最终降解产物为谷氨酸，对人体和环境友好、无毒副作用，由于其具有良好的生物相容性，因此，γ
‑
聚谷氨酸可作为肥料、农药增效剂、保水剂、重金属离子吸附剂、絮凝剂、缓释剂以及药物载体等，在食品、环境、化妆品和医药等工业领域得到广泛应用。
[0004]γ
‑
聚谷氨酸的生产方法包括化学合成法、酶转化法和生物发酵法等。相对于化学合成法和酶转化法工艺复杂、反应条件苛刻等缺点，生物发酵法工艺简单、反应条件温和、原材料廉价易得，容易实现产业化生产，因此近年来呈现出蓬勃发展的趋势。
[0005]苏国金通过向发酵液中滴加硫酸控制pH的方法，发酵周期45
‑
60h，得到聚谷氨酸发酵液含量可达50
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65g/L，该专利技术未提及所得聚谷氨酸分子量，其专利技术专利公布号为CN 111172212A；杨齐等专利技术了一种化妆品级γ
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聚谷氨酸的制备工艺，所得产品分子量为800
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1200kDa，专利技术专利公布号为CN 110106212 A。其生物发酵法仍然存有一定缺陷，主要是发酵过程pH较难稳定控制，以及发酵体系中γ
‑
聚谷氨酸分解酶的存在，使得发酵得到的γ
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聚谷氨酸多分散性、分子量较小，多在1000kDa以下，因此在规模化生产中较难同时满足高分子量和高含量的要求。

技术实现思路

[0006]针对上述技术缺陷，本专利技术提供一种高分子量、高产量的γ聚谷氨酸的发酵方法。
[0007]为解决上述技术问题，本专利技术所提供的技术方案是：一种高分子量γ聚谷氨酸的发酵方法，包括斜面种子培养、二级种子培养和发酵培养的步骤，其特征在于：所述的发酵培养是指将二级种子液按10～15％的体积比例接种到发酵罐的发酵培养基中进行好氧发酵，发酵初始pH设定为6.0～7.0，通过流加5～15％(WT)氢氧化钠溶液控制发酵过程pH 6.0～7.0，发酵至8
‑
9h，当pH自然上升至高于初始设定pH值时，通过间歇性流加补料抑制pH继续回升，使发酵过程pH不超7.5；所述补料组分为谷氨酸30～70g/L，磷酸二氢钾2～8g/L,硫酸铵2～8g/L。
[0008]进一步：在上述高分子量γ聚谷氨酸的发酵方法中，所述发酵培养温度30
‑
38℃，搅拌转速200
‑
650rpm，通风量0.5
‑
1.5vvm，罐压0.05～0.08MPa。发酵培养20～24h时，在发酵液中流加浓度为500
‑
750g/L的葡萄糖溶液，直至发酵结束。
[0009]所述斜面种子培养是指从
‑
72℃冰箱取出γ聚谷氨酸生产甘油种，均匀涂布茄子瓶斜面，恒温培养温度30
‑
38℃，培养时间18
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24h，待培养基表面生长出光滑、均匀、饱满、光泽度好的菌落，制备成茄瓶斜面菌苔。
[0010]所述二级种子培养是指将茄瓶斜面菌苔用100ml无菌水洗脱、打散、摇匀制成菌悬液，吸取1ml置于含100ml无菌水的三角瓶内制成种子液，转接于二级种子罐的二级种子培养基中，得二级种子液；所述培养温度30
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38℃、培养时间6～12h。721可见分光光度计测定OD600达到7～12时。
[0011]所述γ聚谷氨酸生产菌株为枯草芽孢杆菌(B.subtilis)。
[0012]所述二级种子培养基组分：葡萄糖20～50g/L；硫酸镁0.1～1.0g/L；酵母膏5～12g/L；蛋白胨1～6g/L；谷氨酸钠20～70g/L；磷酸二氢钾1～5g/L；消泡剂0.2～1.0ml/L。
[0013]所述发酵培养基组分：葡萄糖50～90g/L；硫酸镁0.1～1.0g/L；酵母膏5～12g/L；蛋白胨2
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10g/L谷氨酸钠30～80g/L；磷酸二氢钾2～6g/L；消泡剂0.2～1.0ml/L。
[0014]补料的具体方式为：间歇性流加、流加量150
‑
400g/h，以控制pH不超7.5为原则；
[0015]补糖流加具体方式为：连续性流加、流加量150
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300g/h,控制发酵液中还原糖浓度5～15g/L。
[0016]与现有技术相比，所述的发酵培养是指将二级种子液按10～15％的体积比例接种到发酵罐的发酵培养基中进行好氧发酵，发酵初始pH设定为6.0～7.0，通过流加5～15％(WT)氢氧化钠溶液控制发酵过程pH 6.0～7.0，发酵至8
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9h，当pH自然上升至高于初始设定pH值时，通过间歇性流加补料抑制pH继续回升，使发酵过程pH不超7.5；所述补料组分为谷氨酸30～70g/L，磷酸二氢钾2～8g/L,硫酸铵2～8g/L。发酵过程随着谷氨酸的聚合，体系中游离H+减少，加上氮源代谢释放氨基酸，使发酵液pH逐渐升高。当pH升至7.5以上时，受发酵体系中γ聚谷氨酸分解酶的作用，谷氨酸分子间的γ酰胺键发生断裂，产物降解成短肽甚至谷氨酸单体，分子结构的规则性遭到破坏，由长链断裂成短片段或三角形态，γ聚谷氨酸含量显著降低。通过补料的方式向发酵液中补充含有底物谷氨酸、缓冲剂磷酸二氢钾的补料液，一方面利用谷氨酸、磷酸二氢钾的酸性来中和发酵体系的碱性，保持发酵过程pH稳定、谷氨酸聚合反应可持续进行，发酵体系内产物不易降解，谷氨酸聚合链持续延长，可得高分子量γ聚谷氨酸；分子量越大，γ
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聚谷氨酸的吸水性和保水性越强，应用领域相对更广阔。分子量≥2000KDa的γ
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聚谷氨酸具有长效保湿、隔离污染的功能，可有效减少干燥环境中皮肤表面水分的散失。另一方面为培养基体系补充发酵代谢底物谷氨酸，同时减弱或解除基础培养基底物过量引起的反馈抑制，补充流加的谷氨酸可直接转化成聚谷氨酸，提高谷氨酸转化率。
具体实施方式
[0017]下面结合具体实施例对本专利技术做进一步说明。以下操作中，未做详细说明的，均可按照分子生物学实验手册进行。
[0018]实施例1
[0019]将γ聚谷氨酸甘油保存种液均匀涂布于茄子瓶斜面，置于36℃恒温培养箱培养24h，取100ml无菌水将斜本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高分子量γ聚谷氨酸的发酵方法，包括斜面种子培养、二级种子培养和发酵培养的步骤，其特征在于：所述的发酵培养是指将二级种子液按10～15％的体积比例接种到发酵罐的发酵培养基中进行好氧发酵，发酵初始pH设定为6.0～7.0，通过流加5～15％(WT)氢氧化钠溶液控制发酵过程pH 6.0～7.0，发酵至8
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9h，通过间歇性流加补料使发酵过程pH不超过7.5；所述补料组分为谷氨酸30～70g/L，磷酸二氢钾2～8g/L,硫酸铵2～8g/L。2.根据权利要求1所述的高分子量γ聚谷氨酸的发酵方法，其特征在于：所述发酵培养温度30
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38℃，搅拌转速200
‑
650rpm，通风量0.5
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1.5vvm，罐压0.05～0.08MPa。3.根据权利要求2所述的高分子量γ聚谷氨酸的发酵方法，其特征在于：发酵培养20～24h时，在发酵液中流加浓度为500
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750g/L的葡萄糖溶液，直至发酵结束。4.根据权利要求3所述的高分子量γ聚谷氨酸的发酵方法，其特征在于：所述斜面种子培养是指从
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72℃冰箱取出γ聚谷氨酸生产菌株(甘油保存种)，涂布茄子瓶斜面，恒温培养温度30
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38℃，培养时间18
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24h，制备成茄瓶斜面菌苔。5.根据权利要求4所述的高分子量γ聚谷氨酸的发酵方法，其特征在于：所...

【专利技术属性】
技术研发人员：张小兰，余军葳，陆可，李嫦，吴伟喆，王海波，谢畅丰，
申请(专利权)人：广东肇庆星湖生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：