新的淀粉酶及其用途制造技术

本发明专利技术涉及新鉴定的多核苷酸序列，该多核苷酸序列包含编码从黑曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）中分离的新淀粉酶的基因。本发明专利技术包括新基因的全长核苷酸序列，包含新淀粉酶全长编码序列的ｃＤＮＡ序列，以及全长功能蛋白的氨基酸序列及其功能等同物。本发明专利技术还涉及这些酶在工业生产中的应用方法和真菌感染诊断方法。本发明专利技术还包括用本发明专利技术的多核苷酸转化的细胞，和其中本发明专利技术的淀粉酶经遗传修饰使其活性和／或表达水平得以提高或降低的细胞。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及新鉴定的多核苷酸序列，包括编码从黑曲霉(Aspergillus niger)中分离的新淀粉酶的基因。本专利技术包括新基因的全长核酸序列，包含新淀粉酶全长编码序列的cDNA序列，以及全长功能蛋白的氨基酸序列及其功能等同物。本专利技术还涉及这些酶在工业生产中的应用方法和真菌感染诊断方法。本专利技术还包括用本专利技术的多核苷酸转化的细胞，和其中本专利技术的淀粉酶经遗传修饰使其活性和/或表达水平得以提高的细胞。
技术介绍
工业生产中，依靠无机酸或酶的催化作用将淀粉水解成葡萄糖。目前优选使用酶，其可提高产量并带来有益经济效益等多种优势。酶促水解可在更大程度上控制淀粉水解、反应特异性和产物的稳定性。温和的反应条件包括较低的温度，接近中性的pH，由此减少不想要的副反应。少有风味不佳和颜色不佳的化合物特别是5-羟基-2-甲基糠醛、葡糖酐化合物和多余的盐产生。酶法还因其能耗低并可省去中和步骤而受到欢迎。阿尔法-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)或α-淀粉酶催化寡糖和多糖中的1，4-α-糖苷键的内水解(endohydrolysis)。它们也被称作1，4-α-D-葡聚糖葡聚糖水解酶(glucanohydrolase)，高峰淀粉酶(Taka淀粉酶)，内淀粉酶或糖原酶。α-淀粉酶以随机的方式作用于淀粉、糖原以及相关多糖和寡糖；还原基团以α-构型被释放出来。β-淀粉酶(E.C.3.2.1.2)催化多糖中的1，4-α糖苷键水解，从链的非还原端去除连续麦芽糖单元。它还被称作1，4-α-D-葡聚糖麦芽糖水解酶，糖淀粉酶，糖原酶。β淀粉酶作用于淀粉，糖原和相关的多糖和寡糖，通过转化产生β-麦芽糖。葡糖淀粉酶(E.C.3.2.1.3)催化末端1，4连接的α-D-葡萄糖残基从链的非还原端连续地水解，释放β-D-葡萄糖。它还被称作葡聚糖1，4-α-葡糖苷酶。1，4-α-D-葡聚糖葡糖水解酶(glucohydrolase)、淀粉葡糖苷酶、γ-淀粉酶、溶酶体α-葡糖苷酶、外-1，4-α-葡糖苷酶。当序列中接下来的键是1，4时大多数形式的该酶能迅速地水解1，6-α-D-糖苷键，有些这种酶的制剂在其他多糖中能水解1，6-和1，3-α-D-糖苷键。淀粉酶可便利地由微生物产生。微生物淀粉酶可从多种来源获得；细菌酶通常来源于芽孢杆菌属，而真菌酶通常由曲霉菌属产生。鉴于大多数真菌淀粉酶最适于低pH条件，所以易于利用酸性条件进行糖化作用。这种条件减少了多余的异构化反应形成的果糖和其他的糖，从而提高了葡萄糖的产量。而且酸性条件限制了在糖化作用反应器中的污染微生物的生长。淀粉酶有多种工业用途，包括烘焙糕点、酿酒、玉米浆和乙醇生产以及醋发酵。发芽小麦，大麦，细菌，和真菌是烘焙用α-淀粉酶的典型来源。真菌α-淀粉酶以稀释粉末、预包装剂量、或水分散性片剂的形式添加到面包面团中。所述的酶可能是在面包房，偶尔在制造厂时加入到面粉中。在制造厂中当下述谷物的面粉与终产品混合时，发芽的小麦和大麦也可以作为淀粉分解活性的来源。细菌α-淀粉酶的性质允许其可以应用于生产早餐点心、果料蛋糕、核仁巧克力饼、小甜饼、零食、和饼干。真菌α-淀粉酶，通常来自米曲霉(A.oryzae)、黑曲霉(A.niger)泡盛曲霉(A.Awamori)或根霉属菌种，用于补充面粉中的淀粉分解活性。这些来源的酶可使生面团中可发酵单糖和二糖的水平从天然的0.5％提高到可促进酵母生长的浓度。添加的真菌酶和内源酶持续释放葡萄糖和麦芽糖可为面团发酵过程中的酵母代谢和气体产生提供必需的营养物。在烘焙应用中，有时候使用米曲霉α-淀粉酶要优于使用来自芽孢杆菌的细菌酶，这是因为真菌酶在60-70℃下是热不稳定的所以经烘烤过程不能存活。其热不稳定性防止酶作用于制得的面包中的糊化淀粉而产生软或粘的面包屑。细菌α-淀粉酶的效果也不错，但需小心地控制使用剂量以免使生产的面包口感胶粘。由于白面包粉含有6.7-10.5％的残损淀粉(damaged starch)，所以补充淀粉酶也是有益的并且有时是必要的。添加的酶可比小麦β-淀粉酶更有效地降解通常存在于粗面粉中的残损或断裂的淀粉颗粒(Bigelis R.Enzymes inFood processing，Nagodawithana和Reed编Acad.Press Inc p121-158及其中引用的参考文献)。除改善面包卷、小圆面包和饼干的品质之外，在制造这些烘焙产品的过程中添加淀粉酶还可以改善面包的其他品质特性。在面包烘焙过程中使用真菌或细菌淀粉酶进行处理可以降低生面团的粘性，使其更易于人工或机器操作。适当剂量的酶还可以降低面包的压缩率，从而生产出更松软的面包。而且，这种生产过程通过降低凝胶淀粉的粘性以及在蛋白变性和酶失活使面包的体积固定下来以前的烘烤过程中使其进一步膨胀而增大面包的体积。同时也观察到其对口味、面包皮性质和烤吐司品质的良好作用。经品尝员测定，面包的贮存特性也得以改变，产品面包屑更松软、更具压缩性，变硬的过程更缓慢并可以保存更长时间。淀粉分解活性还可以提高面包中的糖浓度，从而生产出具有感官优势的更香甜的产品(Bigelis R.inEnzymes in Foodprocessing，Nagodawithana和Reed编，Acad.Press Inc p121-158及其中引用的参考文献)。在酿造过程中，添加的酶可以促进内源大麦β-淀粉酶的作用，并对淀粉消化过程起辅助作用。这种添加酶在使用称作添加剂的未发芽谷粒如玉米和稻米时尤其重要。由于这些添加的谷粒缺乏碳水化合物分解酶，真菌β-淀粉酶和葡糖淀粉酶可以增加淀粉的消化，减少未发芽谷粒的比例，并保证混合物的均匀一致性。淀粉酶可以溶解大麦的直链淀粉和支链淀粉，使这些底物暴露于大麦β-淀粉酶进行进一步地降解。结果使麦芽糖和小分子糊精的水平提高，最终获得促进酵母发酵的麦芽汁组分。具有低转葡糖苷酶活性的淀粉酶制剂是有利的，这是由于微量水平的这种酶产生异麦芽糖和潘糖，而这两种糖都是不能被酵母发酵的。应用于酿造的淀粉酶活性的来源通常是来自曲霉菌，如黑曲霉或米曲霉的酶。这些来源的蛋白酶可以和淀粉酶一起添加来溶解蛋白质并释放酵母增殖所必需的氨基酸(Bigelis R.inEnzymes inFood processing，Nagodawithana和Reed编.Acad.Press Inc p121-158及其中引用的参考文献)。在上述过程，使用由重组DNA方法获得的酶是有利的。这些重组酶与相应的传统纯化产物相比有许多优点。重组酶生产成本低、产量高、而且没有像细菌或病毒之类的污染媒介物，也没有细菌毒素或其他酶活性的污染。真菌中淀粉酶的分子克隆已有描述。来自米曲霉，黑曲霉和A.shirousamii的某些α-淀粉酶的DNA以及推定的氨基酸序列已由Wirsel等Mol.Microbiol 1989，(1)3-14，Boel等，Biochemistry 1990(29)6244-6249，和Shibuya等，Biosci.Biotech.Biochem.1992(56)174-179公开。来自解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的一种α-淀粉酶的分子克隆已由Takkinen等在J.Biol.Chem.1983本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的多核苷酸，其可与选自下组的多核苷酸杂交，所述的组由ＳＥＱＩＤＮＯ：１，ＳＥＱＩＤＮＯ：２，ＳＥＱＩＤＮＯ：３，ＳＥＱＩＤＮＯ：４，ＳＥＱＩＤＮＯ：５或ＳＥＱＩＤＮＯ：６组成，或由ＳＥ ＱＩＤＮＯ：７，ＳＥＱＩＤＮＯ：８，ＳＥＱＩＤＮＯ：９，ＳＥＱＩＤＮＯ：１０，ＳＥＱＩＤＮＯ：１１或ＳＥＱＩＤＮＯ：１２组成。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：D梅尔，A斯托克，C瓦格纳，U福尔克斯，K阿尔伯曼，S霍普，
申请(专利权)人：DSMIP资产有限公司，
类型：发明
国别省市：NL[荷兰]