除草剂的新靶标和对所述的除草剂有抗性的转基因植物制造技术

本发明专利技术涉及具有ａｒｏｇｅｎａｔｅ脱氢酶活性的新酶，特别是植物的ａｒｏｇｅｎａｔｅ脱氢酶以及编码所述酶的基因。本发明专利技术的ａｒｏｇｅｎａｔｅ脱氢酶催化酪氨酸生物合成代谢途径的最后一步并因此构成除草剂的潜在靶标。因此本发明专利技术也涉及鉴定以所述的酶为靶酶的除草剂的方法，所述的除草剂化合物通过与所述的酶结合而防止酪氨酸的生物合成。本发明专利技术还涉及对以参与酪氨酸生物合成途径的酶为靶酶，特别是以参与转化Ｌ－酪氨酸为预苯酸的酶，具体是ａｒｏｇｅｎａｔｅ脱氢酶为靶酶的除草剂，有耐受性的转基因植物。这些植物成为耐受性是由于在植物组织中表达了预苯酸脱氢酶，此酶对所述的除草剂不敏感并使植物即使在用所述的除草剂处理后仍能合成酪氨酸。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及具有arogenate脱氢酶活性的新酶，具体是植物arogenate脱氢酶，还涉及编码这些酶的基因。本专利技术的arogenate脱氢酶催化酪氨酸生物合成代谢途径的最后一步，由于这一点，构成民除草剂的潜在靶标。因此，末专利技术还与涉及鉴定以这些酶为靶酶的除草剂化合物的方法，所述的除草剂化合物通过附着所述的酶而防止酪氨酸的生物合成。本专利技术也涉及以参与酪氨酸生物合成途径的酶为靶酶，特别是以参与预苯酸转变成L-酪氨酸的酶为靶酶，具体是以arogenate脱氢酶为靶酶的除草剂化合物具有耐受性的转基因植物。这些植物成为耐受性是由于在植物组织中表达了预苯酸脱氢酶，此酶对所述的除草剂不敏感并使植物即使在用所述除草剂化合物处理后仍能合成酪氨酸。芳香族氨基酸的生物合成途径桅了植物、细菌和真菌必需的代谢途径。除了生物合成酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸外，这个代谢途径在产生许多次级芳香代谢产物的过程中，包括诸如植物-微生物相互作用，结构性生物高聚物如木质素和软木脂生物合成、激素合成、或苯醌合成中都起着非常重要的作用。在具有此代谢途径的所有生物中，已鉴定到两条预苯酸转变成酪氨酸的途径(附图说明图1；Stenmark等，1974)。在大部分含有叶绿素的细菌，一些微生物和大部分植物中，L-酪氨酸是通过arogenate合成途径合成的(Abou-Zeid等，1995；Byng等，1981；Connely和Conn 1986；Frazel和Jensen 1979；Gaines等，1982；Hall等，1982；Keller等，1985；Mayer等，1985)。在此途径中，预苯酸通过一种特殊的转氨酶预苯酸转氨酶(EC 2.6.1.57)转氨而形成arogenate，然后arogenate通过arogenate脱氢酶(EC 1.3.1.43；图1 ADH)转变成L-酪氨酸。以不同的方式，在生物体中如大肠杆菌或酵母中，预苯酸起初是通过预苯酸脱氢酶(EC 1.3.1.12，EC 1.3.1.13)转变成p-羟苯基-丙酮酸，然后p-羟苯基-丙酮酸再转氨成为L-酪氨酸(Lingens等，1967)。由于其在植物的酪氨酸生物合成途径中的作用，arogenate脱氢酶构成了新除草剂的一个潜在靶标。参此代谢途径的其它酶也构成除草剂的主要靶标。例如，可提及的有参与预苯酸合成途径上游的5-炳烯醇-草莽酸3-磷酸合成酶(EPSPS)，它是所有除草剂草甘膦的靶酶。还可提及的有参与p-羟苯基丙酮酸转变成尿黑酸的p-羟苯基丙酮酸双加氧酶(HPPD)。HPPD是除草剂新家族的靶酶，它的作用导致叶子漂白(Schulz等，1993；Secor 1994)。这些除草剂具体是异唑(EP 418 175，EP 470 856，EP 487352，EP 527 036，EP 560 482，EP 682 659，US 5 424 276)，特别是异恶唑草酮，一种选择玉米的除草剂；二酮腈(EP 496 630，EP 496 631)具体是2-氰-3-环丙基-1-(2-SO2CH3-4-CF3苯基)丙烷-1，3-二酮和2-氰-3-环丙基-1-(2-SO2CH3-4，2，3-Cl2苯基)丙烷-1，3-二酮；三酮类(EP 625 505，EP 625 508，EP 5,506,195)，特别是磺草酮(sulcotrione)或中三酮，或其它的二氢化吡唑类。以植物必需的代谢途径中的酶为靶酶的除草剂的一个优点，是它们对远亲缘性植物具有广谱活性。然而，当这些除草剂应用于农作物以除去不需要的植物或“杂草”时，它们的主要缺点是也作用于种植物。。这个缺点可以通过种植对所述除草剂有耐受性的植物而得到克服。这些植物通常通过遗传工程获得，即在它们的基因组中引入编码对所述除草剂有抗性的一种酶的基因，以此方式这些植物在其组织中过量表达所述的酶。迄今为止，有三种主要运用遗传工程技术的策略得到应用以使植物对除草剂产生抗性。第一种包括通过用编码一解毒酶的基因转化植物使之能解毒除草剂。此酶把除草剂或其活性代谢产物转变成没有毒性的降解物，例如，对溴苯腈或是对basta有耐受性的酶(EP 242 236，EP 337 899)。第二种策略包括用编码经某种方式突变而对除草剂或其活性代谢物不大敏感的靶酶的基因转化植物，例如，对草甘膦有耐受性的酶(EP 293 356，Padgette S.R.等，J.Biol.Chem.，266，33，1991)。第三种策略包括过量表达敏感的靶酶以至于在植物体中产生大量的靶酶，如果可能的话产生远大于进入植物中的除草剂的量。采用此策略曾成功的得到了对HPPD抑制剂有耐受性的植物(WO 96/38567)，使得即使其抑制物存在时也可能维持足量水平的功能性酶。存在着分类学不同分级的两种L-酪氨酸生物合成途径，尤其是植物中还没有发现将预苯酸直接转变成p-羟苯基丙酮酸的途径，这些事实使得可能设想第四种使植物耐受除草剂的策略。具体说，在使用以植物中的arogenate脱氢酶为靶酶的除草剂化合物时，有目的地用细菌或酵母预苯酸脱氢酶的编码基因转化植物，将能使所述植物合成L-酪氨酸而产生耐受性，因此即使所述除草剂化合物能抑制arogenate脱氢酶，所述植物仍对除草剂化合物有耐受性。因此这种新策略包括通过走到用arogenate胱氢酶的酪氨酸生物合成天然代谢途径的一个旁路，在植物中有目的制造对除草剂的抗性，方法是人为地在这些植物中植入踟氨酸生物合成中利用预苯酸脱氢酶一种新的代谢途径。拥有此旁路的植物宜为农业植物，特别是杂草，将对所述除草剂化合物敏感。专利技术概述本专利技术因此涉及编码具有arogenate脱氢酶活性的酶的新分离的多核苷酸。按照本专利技术，术语“多核苷酸”意指天然或人造的核苷酸序列，可以是DNA或RNA类型，更好的是DNA类型，特别是双链DNA。“有arogenate脱氢酶活性的酶”这种表达方式意指此酶能将arogenate转变成L-酪氨酸。Arogenate脱氢酶的活性可以通过检测arogenate底物量的减少，或是通过检测酶反应产物即L-酪氨酸或辅因子NADPH的积累等方法进行测量。具体讲，可用实施例4所描述的方法检测arogenate脱氢酶活性。按照本专利技术的一个具体实施方案，编码arogenate脱氢酶的多核苷酸包括编码选自序列标识符SEQ ID NO3，SEQ ID NO5，SEQ ID NO7，SEQ ID NO9，SEQID NO11或SEQ ID NO13的多肽序列的多核苷酸。本领域技术人员熟知此定义包括编码相同的氨基酸序列的所有多核苷酸尽管有由于遗传密码子的简并性可导致核苷酸序列不同，这些氨基酸序列由序列号SEQ ID NO3，SEQ ID NO5，SEQ ID NO7，SEQ ID NO9，SEQ ID NO11或SEQ ID NO13为代表。本专利技术还包括编码arogenate脱氢酶选择性与上述多核苷酸之杂交的，或组成探针的这些多核苷酸的分离的多核苷酸。按照本专利技术，“能选择性杂交的多核苷酸”含义是指该多核苷酸以本领域溶胀的方法(Sambrook等，1989，分子克隆实验操作手册，Nolan C.编，纽约冷泉港实验室出版社)，与上述多核苷酸杂交或与其衍生的探针杂交，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码具有ａｒｏｇｅｎａｔｅ脱氢酶活性的酶。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：M马特林格，P里珀特，
申请(专利权)人：阿方蒂农科股份有限公司，
类型：发明
国别省市：FR[法国]