溶栓酶基因、重组蛋白及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种溶栓酶基因、重组蛋白及其制备方法；涉及血栓溶解物质；具体地说，涉及一种溶栓酶基因及由其表达产生的蛋白质和制备方法；还涉及一种溶栓酶基因的来源菌株和两种含有该基因的重组菌株。通过核苷酸序列和氨基酸序列比较以及功能研究，表明该酶为一种新的纤维蛋白溶解酶，用纤维蛋白平板法测算酶的活力为４１０００ＩＵ／ｍｇ。该酶兼有拮抗机体氧化损伤的功能，对血红素、ＮａＮＯ↓［２］和Ｈ↓［２］Ｏ↓［２］引起的蛋白质氧化有显著的抑制作用。本发明专利技术所涉及的溶栓酶Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ　　ＱＫ与目前国内外上市或在研的溶栓药物比较有以下优点：高活性；抗氧化；抗ＰＡＩ－１抑制作用；纤维蛋白特异性；在血液中的半衰期长，降低了再梗塞的几率；成本低；因此，该酶在心血管疾病治疗中有重要的应用价值。（*该技术在2024年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及血栓溶解物质；具体地说，涉及一种溶栓酶基因及由其表达产生的蛋白质、制备方法；本专利技术还涉及一种溶栓酶基因的来源菌株和两种含有该基因的重组菌株。
技术介绍
血栓栓塞性疾病的致残率和病死率都很高，严重威胁人类生命和健康，全世界约有病人1500万。目前，由于各种原因引起的血液栓塞疾病，如脑血栓、心肌梗塞、冠心病、肢体血管栓塞等的发病率呈上升趋势，仅我国每年用于防治和康复等方面的费用高达数千亿元人民币，此类疾病严重危害了患者的生存质量，增加了患者家庭及社会的负担。溶栓治疗是治疗血栓疾病的有效手段，因此溶栓和溶栓辅助药物的研制进展迅速。目前，国内外上市或在研的溶栓药物很多，从原料来源上，可分为3类(1)基因重组产品，如重组链激酶、重组水蛭素、t-PA等；(2)生物工程产品，如葡激酶、纳豆激酶等；(3)生化药品，如尿激酶、降纤酶、蛇毒溶栓酶、蚓激酶等。国内外已正式批准临床使用的主要溶栓药物有链激酶(Streptokinase，SK)、尿激酶(Urokinase-type plasminogen activator，u-PA)、重组组织型溶栓酶原激活剂(Recombinan tissue-type plasminogen activator，rt-PA)、对-甲氧苯甲酰溶栓酶原链激酶激活剂复合物(Anisoylated plasminogenstreptokinase activator complex，APSAC)和重组链激酶(Recombinantstreptokinase，r-SK)。目前来看，各类溶栓药物疗效可以肯定，但是还存在一些缺陷，阻碍了溶栓疗效的进一步提高。主要问题有以下几方面 (1)伴随着血栓形成的机体的氧化损伤蛋白质和脂质的氧化是伴随着心血管疾病而发生的，氧化的蛋白质和脂质使机体的损害加重，至今未见报道现有溶栓药物具有对机体氧化损伤的保护作用。(2)出血是最常见的不良反应，与其药理作用和使用的剂量有一定关系。表现为单纯穿刺部位渗血，轻度皮下，呼吸道，泌尿道或消化道出血，颅内出血发生率为0.5％～1％。(3)再梗塞急性心肌梗塞治疗后，发生再梗塞是国内外至今未能解决的难题。再梗塞的主要原因是①纤溶系统被激活后可活化血小板，使血小板膜糖蛋白受体Gp IIb/IIIa发生构象变化，使纤维蛋白原和Von Willebrand因子聚集于血小板上Gp IIb/IIIa受体，促进血栓形成。同时血小板对溶栓酶的作用不敏感，现有溶栓药物对富含血小板的血栓治疗效果较差。②rt-PA，rscu-PA等溶栓药物半衰期很短，在血循环中被肝脏快速清除。③溶栓治疗后残留血栓表面吸附有大量凝血酶，溶栓治疗后启动凝血过程，导致血栓再次形成。(4)由于有一些被批准的溶栓药物成本很高，因而治疗费用也不菲，给患者和社会增加了负担。为克服现有溶栓药物的上述局限性，有许多新型溶栓药物正在研制开发中。增强纤维蛋白选择性，延长半衰期，抗PAI-1抑制作用，寻找低成本的溶栓药物等是主要的研究目标。
技术实现思路
在我们的研究中，用水稻叶包裹大豆发酵和纤维蛋白平板测定纤溶活性的方法获得了一株能高效分泌溶栓酶的枯草杆菌。经中国典型培养物保藏中心鉴定，该菌株为一种新的枯草杆菌，命名为Bacillus subtilis QK02。随后扩增了QK蛋白酶的基因qk，并制备了含该基因的重组质粒和重组菌株，利用重组表达菌株表达了重组QK蛋白酶。用纤维蛋白平板法测得重组QK蛋白酶的纤溶活力达到41000IU/mg，后来我们详细地研究了该酶的基本酶学性质，值得一提的是，我们的实验表明，该酶还具有抗氧化的功能。由于该酶是首次发现的兼具氧化功能的候选溶栓剂，对血栓栓塞性疾病的预防、治疗、诊断是一次具有重大意义的突破。本专利技术的目的是提供蛋白酶QK的基因、重组蛋白及其制备方法。本专利技术提供的溶栓酶基因最初来源于枯草杆菌Bacillus subtilis QK02菌株。在本专利技术中，专利技术者取湖北武汉地区的水稻叶85℃热处理10分钟，用其包裹灭过菌的大豆，42℃培养24小时后用培养液浸泡培养过的大豆，再将培养液作适当稀释后涂布营养琼脂平板，从营养平板上获得的菌落接种到5ml培养液中37℃培养24小时，离心后用纤维蛋白平板法测定上清液的溶栓酶活性，选取酶活性最高的菌株，再重复筛选过程而获得枯草杆菌Bacillus subtilis QK02菌株，保藏号CCTCC M203078。本专利技术是基于专利技术人的下述发现而完成的通过检测降解纤维蛋白能力的方法筛选到了枯草杆菌Bacillus subtilisQK02菌株，进而发现培养该菌能够产生大量的溶栓酶QK，纤维蛋白平板实验表明该酶具有很高的溶解纤维蛋白的能力。除此之外，专利技术人还发现该酶在体内外及血管内皮细胞中具有拮抗由血红素、NaNO2和H2O2带来的氧化损伤的能力。本专利技术通过检测纤维蛋白降解的方法筛选到了株枯草杆菌Bacillussubtilis QK02，它经中国典型培养物保藏中心鉴定并保存，保存序号为CCTCCNoM203078。从该菌中利用PCR的方法得到编码溶栓酶QK的基因qk，它是一个828bp的DNA分子，其DNA序列即蛋白酶QK的基因qk的核苷酸序列(SEQ ID NO1)。SEQ ID NO1GCG CAA TCT GTT CCT TAC GGC ATT TCT CAA ATT AAA GCG 39CCG GCT CTT CAC TCT CAA GGC TAC ACA GGC TCT AAC GTA 78AAA GTA GCT GTT ATC GAC AGC GGA ATT GAC TCT TCT CAT 117CCT GAC TTA AAC GTC AGA GGC GGA GCA AGC TTC GTA CCT 156TCT GAA ACA AAC CCA TAC CAG GAC GGC AGT TCT CAC GGC 195ACA CAC GTA GCC GGT ACG ATT GCC GCT CTT AAT AAC ACA 234ATC GGT GTT CTG GGC GTA GCG CCA AAC GCA TCG TTA TAT 273 GCA GTA AAA GTT CTT GAC TCA ACA GGA AGC GGC CAA TAC 312AGC TGG ATT ATT AAC GGC ATT GAG TGG GCT ATT TCC AAC 351AAT ATG GAT GTT ATC AAC ATG AGC CTT GGC GGA CCT TCT 390GGA TCT ACA GCT CTG AAA ACA GTC GTT GAT AAA GCA GTT 429TCC AGC GGT ATC GTC GTT GCT GCC GCT GCC GGA AAC GAA 468GGT TCA TCG GGC AGC ACA AGC ACA GTC GGC TAC CCT GCA 507AAA TAT CCT TCT ACC ATT GCG GTA GGT GCG GTA AAC AGC 546AGC AAC CAA AGA GCT TCA TTC TCA AGC GCA GGT TCT 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种具有ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：１所示核酸序列的溶栓酶基因。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：齐义鹏，高柱虎，闫俊鹏，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：83[中国|武汉]