本发明专利技术公开一种建立黑麦草转基因受体体系的方法及其应用，主要步骤包括：以一年生或多年生黑麦草无菌种子苗茎尖为材料，在诱导培养基上诱导丛生芽发生，在增殖培养基上丛生芽块持续增殖，转入生根培养基后产生完整植株。在增殖培养基上取适宜生长期的丛生芽块，剥去丛生芽小叶片，裸露生长点，采用基因枪轰击法或农杆菌介导法进行遗传转化，获得转基因植株。在农杆菌介导的遗传转化中，采用表面活性剂Ｓｉｌｗｅｔ Ｌ－７７处理和减压处理有效提高了转化频率，从而建立起一个高效的基因型制约小的黑麦草转基因技术体系。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属作物生物工程育种领域或作物育种领域。具体说，涉及一种建立黑麦草遗传转化体系的方法及应用
技术介绍
黑麦草是禾本科黑麦草属植物，有一年生黑麦草和多年生黑麦草之分。多年生黑麦草又叫宿根黑麦草。一年生黑麦草又叫多花黑麦草或意大利黑麦草，原产于西南欧、北非和亚洲西南，20世纪50年代作为优质牧草被引进我国。黑麦草分蘖多，产量高，质地柔软，绿期长，是良好的绿色饲料；另外其根系发达，适生性强，耐践踏，有耐盐碱潜力，能增加土壤有机质，改善土壤结构，防止水土流失，又是很好的草坪草。多年生黑麦草在城市绿化中广泛应用。然而，多数黑麦草品种耐旱性较差，且耐盐程度也达不到在盐碱地种植的要求。黑麦草为异花授粉作物，采用常规育种技术培育耐盐耐旱品种周期长，难度大。为了适应黑麦草育种工作的需要，黑麦草的离体培养和转基因技术受到越来越多的重视。良好的黑麦草遗传转化体系建立的难度较大，主要是由于已有的黑麦草组织培养和植株再生体系不能满足转基因的需要。1988年Greemers Molenaar以未成熟的多年生黑麦草和一年生黑麦草的花序为外植体，诱导愈伤组织发生，研究了2，4-D和供体植物环境对植株再生的影响，获得了再生植株。但黑麦草愈伤组织诱导率低，且在继代培养过程中胚性容易丧失，再生植株易发生体细胞无性系变异。1994年，陈文品以一年生黑麦草和多年生黑麦草幼穗为外植体，不经愈伤组织阶段，直接从幼穗分化成苗，但只有一年生黑麦草诱导率较高，影响了进一步的应用。黑麦草的遗传转化工作虽开始较早，但进展不大。早在1993年，Hensgens等研究了gusA和水稻基因的融合基因在多年生黑麦草中的瞬时和稳定表达。1994年，Van der Maas等将gusA报告基因转入多年生黑麦草愈伤组织，并研究了其在细胞中的长效表达情况。1995年，Spangenberg等开展了利用微弹轰击法转化多年生黑麦草的胚性悬浮细胞的工作。1997年Ye等用同样方法转化一年生黑麦草胚性悬浮细胞获得转基因植株。1998年，Folling等研究了黑麦草原生质体核酸酶活性的降低对转化效率的影响。同年，Dalton等利用硅碳纤维介导法转化一年生黑麦草和多年生黑麦草悬浮细胞系，分别获得转基因植株。1999年Dalton等又尝试利用微弹轰击法转化一年生和多年生黑麦草。2001年，Ye等将SacB基因转入一年生黑麦草，研究了转基因植株中果聚糖的变化。同年，Xu等获得了抗花叶病毒的多年生黑麦草转基因植株。2003年，Dalton实验室尝试了利用农杆菌介导法转化一年生黑麦草。在以上工作中，选用的遗传转化受体通常为具有再生能力的愈伤组织或悬浮培养细胞，由于愈伤组织诱导率低、继代容易变异、再生能力差，只有几个实验室获得了转基因黑麦草植株，且频率较低，很多实验室转化后未得到转基因植株。因此找到合适的受体系统对黑麦草细胞工程和基因工程研究有重要意义。
技术实现思路
针对上述技术的不足，本专利技术以一年生黑麦草和多年生黑麦草优良品种或黑麦草种属间杂种的无菌种子苗或试管苗的茎尖为材料，在诱导培养基上诱导丛生芽发生，然后转到增殖培养基上产生大量丛生芽，提供转基因的受体材料。采用基因枪轰击法或农杆菌介导法将外源基因导入受体细胞，经选择获得转化细胞及植株。在此基础上，确立了在农杆菌介导的遗传转化中，采用表面活性剂Silwet L-77处理和减压处理有效提高了转化频率，从而建立起一个高效的基因型制约小的黑麦草转基因技术体系。本专利技术主要步骤包括以黑麦草种子苗茎尖或幼穗切段为试验材料，诱导其发生丛生芽，后者在增殖培养基上持续增生，提供转基因的受体材料。利用丛生芽生长点和无菌小苗生长点为受体，采用基因枪轰击法或农杆菌介导法将外源基因导入受体细胞，经选择获得转化细胞及植株，并对转基因植株进行鉴定和选择。本专利技术中所述的黑麦草包括多花黑麦草(一年生黑麦草)品种、多年生黑麦草品种、黑麦草种间杂种品种和黑麦草与羊茅杂种品种。所述的丛生芽是指外植体在培养基上产生的成丛密集的小芽及其继代培养物。丛生芽块是指离体培养的丛生小芽和未组织化的分裂细胞构成的组织块及其继代培养物。所述的转基因受体是指去掉叶片或芽鞘的茎尖离体培养产生的丛生芽生长点或/和无菌小苗生长点。无菌苗可来源于黑麦草种子无菌萌发、或组织培养产生的小苗、或不定芽长成的小苗、或丛生芽分割后长成的小苗。利用丛生芽或无菌苗为受体进行遗传转化时，首先剥去丛生芽小叶或无菌苗叶鞘，裸露生长点，后者用于农杆菌感染或基因枪轰击。本专利技术中的选择剂包括除草剂(绿黄隆、草丁膦、草干膦等)、抗生素(潮霉素、卡那霉素等)。选择剂抗性基因有除草剂抗性基因如als(突变的乙酰乳酸合成酶基因)、bar(基因)等，抗生素抗性基因如hpt(潮酶素磷酸转移酶基因)、nptII(卡那霉素抗性基因)等。所述的培养基配方为丛生芽诱导培养基的组成MS培养基、200-500mg L-1的水解酪蛋白(CH)、蔗糖30-60g L-1、6-BA 0.001-4.0mg.L-1、2，4-D 0.001-2.0mg.L-1、琼脂6.5g L-1，pH5.8-6.0。丛生芽增殖培养基的组成MS培养基、200-500mg L-1的水解酪蛋白(CH)、蔗糖30-40g L-1、6-BA 0.001-3.0mg.L-1、2，4-D0-0.1mg.L-1、琼脂6.5g L-1，pH5.8-6.0。小苗生根培养基的组成1/2MS培养基、200mg L-1水解酪蛋白(CH)、蔗糖20-40gL-1、NAA 0.2-2.5mg L-1、琼脂6.5g L-1，pH5.8-6.0。所述的遗传转化方法可以黑麦草丛生芽或无菌苗茎尖为受体采用农杆菌感染丛生芽块及裸露生长点法。即将丛生芽块及裸露生长点放入菌液中浸染并附以0.98-0.10个大气压(0.98×105Pa-1×104Pa)处理，浸染3-18分钟。然后用无菌滤纸吸去菌液，将感染后组织转入增殖培养基上共培养2-3天，再转入加有适宜浓度选择剂和100-200ppm头孢霉素的筛选培养基上连续筛选3代(每代20天)，获得抗选择剂小苗。将2-3cm的小苗转入生根培养基中生根，获得转化植株。所述的农杆菌(Agrobacterium，包括A.tumefaciens和A.rhizogenes)介导的遗传转化程序基本上同石田(Ishida，1996)等报道的。在转染液中添加乙酰丁香酮(acetosyringone，As)等酚类化合物、表面活性剂Silwet L-77(浓度为0-0.3％)和中性单糖(葡萄糖、木糖)，丛生芽块或裸露茎尖放在悬浮农杆菌的转染液中，在0.98-0.10个大气压(0.98×105Pa-1×104Pa)下浸染3-18分钟，然后在培养基上共培养2-15天。转化体在含有适宜抗生素的培养基上抑菌，在加有合适浓度选择剂的培养基上筛选，然后在增殖培养基上分化小苗。所述的基因枪轰击法(particle bomrdment；microprojectile；biolistics；particle gun)是籍高速度的金属微粒将核酸分子引入活细胞中的一种遗传转化技术。最初是美国康乃尔大学萨伏特(Sanford)等研制成功的火药基因枪及转化技术，此后有不同学者研制出的多种基因枪及不断改进本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种建立黑麦草转基因受体体系的方法及其应用，其特征在于： ①种子萌发小苗的茎尖离体培养及培养基，②茎尖组织诱导丛生芽及培养基，③丛生芽块继代培养，④以丛生芽块为受体进行遗传转化及受体组织继代培养时间和转化参数； 所述的转基因受体体系是指茎尖离体培养产生的丛生芽块及其扩增和继代培养物；丛生芽块是指离体培养茎尖在含有２，４－Ｄ（２，４－二氯苯氧乙酸）和６－ＢＡ（６－苄基嘌呤）的培养基上产生的由丛生小芽和未组织化细胞组成的组织块及其继代培养物。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：杨爱芳，张举仁，尹小燕，张可炜，谷晓峰，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：88[中国|济南]
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