SARS病毒HLA-A2限制性表位多肽及其应用制造技术

一种ＨＬＡ－Ａ２限制性表位多肽，其特征在于，该多肽选自下组：　　　　（ａ）具有ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：１３氨基酸序列的多肽；　　　　（ｂ）将ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：１３氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有诱导细胞毒Ｔ淋巴细胞杀伤活性的由（ａ）衍生的多肽。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物学和医学领域，更具体地涉及一种SARS病毒HLA-A2限制性表位多肽Ssp-1，以及含该表位的复合物、抗原递呈细胞以及针对该表位的特异性免疫效应细胞在SARS治疗及预防中的应用方法。
技术介绍
严重急性呼吸综合征(severe acute respirtory syndrome，SARS)，是一种新出现的传染性疾病。自2002年11月中旬开始，首先出现在我国广东省局部地区，进而迅速蔓延到包括我国香港特别行政区和台湾地区、越南、新加坡、加拿大、德国在内的五大洲的33个国家及地区，至少在6个国家中发生了本地的传播。由于本病传播速度快，人群普遍易感和死亡率较高，已成为严重危害人类健康和生命安全的全球性流行性疾病。此病的临床特征为发热、干咳、呼吸困难、淋巴细胞减少以及肺部影像学呈迅速进行性改变，一些病人可因严重呼吸窘迫致呼吸衰竭而死亡，上呼吸道症状并不显著，部分患者有腹泻症状。使用传统治疗的抗生素无效。在世界卫生组织(WHO)的协调下，全球9个国家13个实验室共同努力，仅用3周的时间就分离出SARS病毒，并完成全基因组测序。2003年4月16日，WHO在病原体分离和基因组测序完成的基础上，正式宣布一种以前未曾报道过的新的冠状病毒为导致SARS的病原体，并命名为SARS冠状病毒(SARSCoronavirus，SARS-CoV)。SARS冠状病毒属正链RNA病毒，基因组全长约为30kb，有11个开放读码框架(ORF)，其中非结构蛋白的基因位于5′端，结构蛋白位于3′端，结构蛋白包括脊突蛋白(spike)、表面蛋白(E)、膜蛋白(membrane)和核蛋白(nucleocapid)。其中，S蛋白在病毒与宿主细胞表面受体结合及介导膜融合进入细胞的过程中发挥着关键作用，也是冠状病毒的主要抗原蛋白。SARS-CoV直径80～220nm，有包膜，包膜上有2～3种糖蛋白，其中一种长的包膜糖蛋白突起长度为20nm。每个突起是由3个S蛋白通过非共价键连接而成，S蛋白三聚体突起具有多方面的功能，它负责结合敏感细胞受体，诱导病毒包膜和细胞膜以及细胞之间的融合，刺激机体产生中和抗体和介导细胞免疫反应。S糖蛋白有4个结构域一个短的C末端构成包膜内区或胞质区一个跨膜区和两个包膜外域(分别称为S1和S2)。其胞质域富含保守的半胱氨酸残基，与S蛋白形成复杂的三级结构，以及突起的组装或与其它病毒蛋白的相互作用有关。跨膜区与S2蛋白相连，含有一段高度保守的序列KWPWYVWL。通常胞质域或包膜内区和跨膜区在S蛋白中所占比例很小，大部分是由S1和S2构成的胞膜外域。在S1和S2之间有一组碱性氨基酸残基，构成胰蛋白酶切割敏感基序，S蛋白的切割是诱导膜融合活性所必须的，但经蛋白酶切割产生的S2和S1并不解离，而是以非共价键结合在一起，除去S1的病毒粒子往往会失去感染性，但也有例外。因此，如果以S蛋白胞外区为靶标，对机体进行免疫，将会使机体产生针对病毒S蛋白的特异性免疫应答，从而使机体能有效地清除病毒，为SARS-CoV的预防及治疗提供措施。合成肽疫苗是近年来随着分子生物学及免疫学的进展而发展起来的一种新的疫苗，可以诱导机体产生特异性的免疫应答，但是其副作用轻微、安全性好，是目前疫苗研究的一个新的方向，广泛应用与抗肿瘤及抗病毒免疫治疗。目前已经有多种基于表位多肽的疫苗进入临床研究或上市。细胞免疫在抗肿瘤和抗病毒免疫中起关键作用。T细胞识别的抗原为与细胞表面的MHCI类或II类分子结合的肽，其长度约为8-12个氨基酸。而作为杀伤肿瘤细胞的主要效应细胞CTLs则识别与MHCI类分子结合的内源性肽。已有证据表明，合成肽能直接与MHCI类分子结合，而不需要APC的加工、处理，它和天然的内源性肤在激活免疫系统方面具有着同等的效力。多肽疫苗已成为目前抗恶性肿瘤的一项新策略，也是目前研究最多的肿瘤治疗性疫苗。研究较多的有以下5种(1)gp 100来源于gp 100的肽G9154(KTWGQYWQV)、G9209(ITDQVPPFSV)均能诱导抗原特异性的CTLs。用之致敏来自HLA-A2+的黑色素瘤患者的外周血淋巴细胞(PBL)，能明显增强诱导特异性CTL的能力诱导的CTLs既能识别未修饰的Gg100。(2)CEAZaremba等人报道CEA的肽CAP1-6D不仅能在体外致敏CEA特异的CTLs，其效力为CAPI的100-1000倍，在体内能诱导CEA特异的CTLs(CAP1却不能)；而且所致敏的CTLS同样能识别CAP1。更为重要的是，这些CTLs能溶破同源的表达CEA的人类肿瘤。(3)MAGE-2MAGE一2广泛存在于黑色素瘤、喉癌、肺癌、肉瘤等多种肿瘤除睾丸外，不存在于正常组织。在MAGE-2中已发现有三段多肤能与MHCI类分子在37℃下形成稳定复合物，其中至少有两个能被HLA-A 0201加工、呈递，成为多肤疫苗研究的新候选者。(4)P21WAFI将P21WAFI的肽与内源化肽融合能抑制肿瘤的生长。(5)HER2/neu来源子HER2/neu的肽在体外能致敏特异性的CTLs，在小鼠体内也能诱导特异的CTLs，且能抑制肿瘤的生长，另外采用HPV多肽疫苗也已经进入临床研究。HLA-A2是一种在我国人群中具有较高分布的一种MHC-I类分子，阳性率在40-60％之间，占MHC-I类分子各个亚群的首位，是疫苗设计中首选的相关分子。随着对MHC I类分子和肤表位分子相互作用的认识的深人，科学家们已建立了较为成熟的表位鉴定技术路线，主要步骤如下①根据表位和MHC I类分子相互作用的特点，预测MHC I类分子限制性CTL表位，并利用计算机分子模拟技术对预测表位进行进一步筛选；②测定表位与MHCI类分子结合力；③利用体外细胞毒分析或免疫荷瘤转基因小鼠鉴定肤表位能否诱导CTL，寻求最佳优势表位。基于这一技术路线，已有多种HLA-A2.1限制性CTL表位被鉴定，有的已在临床显示了较好疗效。T2细胞是用于测定表位与HLA-A2.1分子结合力的工具细胞之一，它是一株抗原递呈转运体缺陷的HLA-A2.1型细胞株，该细胞表面只表达不含有内源性抗原分子的HLA-A2.1分子，从而可利用其与目的肤的结合程度来测定HLA-A2.1分子与目的表位间的亲和力。由于目前尚缺乏有效预防和治疗SARS的方法，因此本领域迫切需要开发新的可用于预防和治疗SARS的抗原，尤其是安全性高的合成肽疫苗。
技术实现思路
本专利技术的目的就是提供一种安全性高、具有高免疫原性的合成肽及其应用。在本专利技术的第一方面，提供了一种HLA-A2限制性表位多肽，该多肽选自下组(a)具有SEQ ID NO13氨基酸序列的多肽； (b)将SEQ ID NO13氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有诱导细胞毒T淋巴细胞杀伤活性的由(a)衍生的多肽。在另一优选例中，该多肽的长度为8-20个氨基酸，更佳地，长度为8-12个氨基酸。在另一优选例中，该多肽具有SEQ ID NO13的氨基酸序列。本专利技术还提供了重组蛋白(如融合蛋白等)，它含有本专利技术上述的HLA-A2限制性表位多肽。在本专利技术第二方面，提供了一种分离的核酸，它编码本专利技术上述的HLA-A2限制性表位多肽。在本专利技术第三方面，提供了一本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：曹雪涛，万涛，王宝梅，陈华彪，张明徽，
申请(专利权)人：第二军医大学免疫学研究所，上海海欣生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：