一种培育无选择标记转基因植物的方法及其专用表达载体技术

本发明专利技术公开了一种培育无选择标记转基因植物的方法及其专用表达载体，其目的是提供一种可高效率培育无选择标记转基因植物的方法及其所用的双标记双Ｔ－ＤＮＡ植物表达载体。本发明专利技术所提供的双标记双Ｔ－ＤＮＡ植物表达载体包含两个独立的Ｔ－ＤＮＡ，其中一个Ｔ－ＤＮＡ含有选择标记基因和绿色荧光蛋白基因，另一个Ｔ－ＤＮＡ携带目的基因。本发明专利技术创造性地把绿色荧光蛋白基因（ｇｆｐ）作为一个可视的剔除标记构建在与选择标记基因相同的Ｔ－ＤＮＡ结构域上。由于ｇｆｐ基因和选择标记基因位于同一Ｔ－ＤＮＡ结构域上，二者在转基因后代植株中偕同遗传，同时由于ｇｆｐ基因能在许多种植物中稳定表达和方便地检测，所以这一体系能普遍适用于大多数包括双子叶植物、单子叶植物在内的作物，具有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种培育转基因植物的方法及其专用表达载体，特别涉及一种培育无选择标记转基因植物的方法及其专用表达载体。
技术介绍
随着植物转基因技术的长足发展，研究人员可以利用多种转化方法将外源基因转化到植物体内，如农杆菌介导法、基因枪法、PEG、电激法等(Sawahel WA，et al.1992.Biotech Advances.10393-412)。利用这些转化方法将外源目的基因导入到植物细胞时，通常只有部分细胞可以成为稳定的转化细胞。因此，一般在转化系统中使用抗生素抗性基因或除草剂抗性基因等作为选择标记基因筛选转化细胞。在选择压力下，不含选择标记基因及其产物的非转化细胞将死亡；转化细胞和组织则整合有选择标记基因而存在抗性，从而能够继续成活并分化成植株(Dale E C，et al.1991.Proc Natl Acad Sci USA.8810558-10562)。选择标记基因的应用使植物基因工程成为可能。然而另一方面，选择标记基因及其蛋白产物毕竟不是基因工程的目的产品。尽管目前的研究表明多数选择标记基因及其产物并未带来安全性隐患，但有些人仍会担心这些基因存在于转基因植物中会带来影响环境和人类健康安全性的问题(Zechendorf B.1994.12870-875)，如选择标记基因及其产物在食用时可能有毒性或会引起过敏反应；尤其是选择标记基因编码产物如具有某一临床或肠道应用的抗生素抗性时，人们担心选择标记基因转移进微生物中将增强病原微生物的抗药性，从而引起抗生素失效。此外，如抗除草剂型的选择标记基因平行转移进野草中，可能会使其转变为难以控制的害草，造成生态平衡的破坏(Dale P J.1992.PlantPhysiol.10013-15)。再者，通过基因工程手段将多个目的基因重复转化导入受体植物中，集中高产、优质，抗虫、抗病等多种性状，是培育作物新品种的一种良策。目前可供利用的选择标记基因为数甚少，经过一次转化获得的转基因植物如已存在选择标记基因，该基因在随后的再次转化中将不能再作为选择标记，但又不可能每次转化都更换新的择标记基因。但假如培育出不含选择标记基因的转基因植物，这个问题即会迎刃而解(Dekeyser R，et al.1989.Plant Physiol.90217-223)。总而言之，建立无选择标记植物转化系统，培育无选择标记的转基因植物无论是从安全性考虑，还是从转基因技术本身考虑均具有着重要的意义。无选择标记转基因植物的研究和培育已成为国际上植物基因工程领域的一个趋势。迄今，已有一些方法可获得不带选择标记基因的转化植物，主要的有转座子成份介导法，位点特异性重组系统介导法及共转化方法等(Yoder J I，et al.1994.Bio/Technology，12263-267)。转座子成分能利用保守的切割粘连机制从植物染色体中的某个位置转移到新的遗传座位，转座后的新座位有一半的机率与原来的遗传座位不连锁。利用转座子成分的这一特性能够去除转基因植物中的选择标记基因和其它多余序列(Yoder J I，et al.1994.Bio/Technology.12263-267)。Goldsbrough等(1993.Bio/Technology.111286-1292)把选择标记nptII基因插入到玉米转座子成分Ds的反向重复序列之间，把报告基因gus构建在Ds反向重复序列外，然后以此载体转化番茄。结果发现在转座酶基因Ac作用下，Ds成分连带nptII基因转移到植物基因组中新的遗传座位。在转基因植株后代中gus基因与nptII基因发生了分离，从而获得了只带gus基因而无抗性标记(nptII)基因的植株。位点特异性重组系统是一类能够通过对特定DNA序列进行切割和重新连接，使其发生重组的DNA重组体系。在转基因植物去除标记基因研究中，应用最为广泛的是来源于大肠杆菌P1噬菌体的Cre/loxP系统。Cre/loxP系统由cre基因编码的38.5KD的重组酶Cre蛋白及其识别切割序列loxP位点组成，loxP序列长34bp，包括8bp的间隔序列及两个13bp的反向重复序列。Cre蛋白能识别两个同向的loxP位点，介导loxP位点连同其中间的片段发生重组而被剔除。Rusell等人(1992.MolGen Genetic.23449-59)将gus基因和编码磺酰脲(sulfonylurea)抗性的(acetolactate synthase，als)基因转入烟草，其中als基因构建在了loxP序列之间。通过农杆菌介导或有性杂交将cre基因导入到已获得的转基因植株体内，在转基因植株后代中可发现磺酰脲抗性阴性，但GUS阳性的转基因植株。Southern杂交结果证实显示als基因已被Cre酶去除。早期的研究需要通过二次转化或有性杂交导入重组酶，(Dale E C，et al.1991.Proc Natl Acad Sci USA.8810558-10562；Russell S H，et al.1992.Mol Gen Genetic.23449-59)。后来进一步发展的可调控表达的位点特异性重组系统可以一次性将目的基因、选择标记基因和重组酶转入受体植株中，然后在适当的时候诱导重组酶表达，进而去除选择标记基因和重组酶基因本身(Sugita K，et al.2000.Plant J.22461-469；Hoff T，et al.2001.Plant Mol Biol.4541-49；Zuo J，et al.2001.Nature Biotechnology.19157-161)。共转化法包括基于基因枪直接转化和农杆菌介导的两种途径。早期的研究发现把目的基因和选择标记基因分置于不同的质粒上，二者混合后经基因枪转化可获得共整合有目的基因和选择标记基因的植株，当两个基因分别整合在受体的不同染色体上时，后代植株即可发生分离从而获得不带选择标记的转化植株。然而由于基因枪转化法存在拷贝数多，外源基因整合方式复杂，其插入受体基因组的序列无规律性，可能携带大段的质粒骨架序列或可能只整合部分的外源基因序列，使这一方法的应用受到了限制，目前已基本不再应用。农杆菌介导的共转化方法主要是基于T-DNA在转化过程中整合于植物基因组中的位置具有一定随机性的原理。该法以两个分离的T-DNA(分别包含目的基因和选择标记基因)共同转化受体植物，获得目的基因与选择标记基因分别整合于不同染色体的转化植株后，再经过遗传分离筛选只携带有目的基因的植株。这一方法的整合方式一般是以可预见的左右边界间的T-DNA插入方式为主，其整合的拷贝数也较基因枪法少得多，从而克服了基因枪法的缺点。Mcknight等(1987.Plant Mol Biol.8439-445)用分别含有nptII基因和胭脂碱合成酶(Nopaline synthase，Nos)基因的两个载体共转化烟草，结果表明，分开的T-DNA在一定条件下共同转化植物时，可以分别整合在植物基因组的不同位点。转化植株后代中，两个T-DNA发生分离，从而获得只含有单基因的转化植株。Komari等(1996.Plant J.10165-174)将两个带有同源序列的T-DNA载体转化到农杆菌中，通过同源本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种双标记双Ｔ－ＤＮＡ植物表达载体，包含两个独立的Ｔ－ＤＮＡ，其中一个Ｔ－ＤＮＡ含有选择标记基因和绿色荧光蛋白基因，另一个Ｔ－ＤＮＡ携带目的基因。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：朱祯，陈松彪，
申请(专利权)人：中国科学院遗传与发育生物学研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]