在由培养基改变调节的絮凝作用下遗传修饰的微生物,质粒以及发酵过程制造技术

本发明专利技术提供了在由改变培养基调节的絮凝作用下遗传修饰的微生物，质粒以及发酵过程，本申请涉及遗传修饰的微生物，产生所述生物体的方法以及利用所述生物体的发酵过程。在发酵过程的末期这些微生物发生絮凝作用，更快速的沉淀在发酵容器的底部，从而于发酵过程中获得的终产物分离开来。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
,质粒以及发酵过程的制作方法
技术介绍
专利
本专利技术涉及在微生物中操作和加入絮凝剂基因用于生产工业原料以及利用所述微生物的方法。更具体地说，本申请涉及遗传修饰的微生物，产生所述生物体的方法以及利用所述生物体的发酵过程。在发酵过程的末期絮凝，更迅速地沉降在发酵容器底部，从而与从发酵期间获得的终产物分离开来。这个过程是一个纯化过程。现有技术的描述自从人类早期历史，人类就知道利用微生物改变以及产生医药或者食物原料，一个基本的例子是富含糖的原料，诸如葡萄，大麦及其他成分发酵“汁液”的过程，发酵后所述原料通过厌氧反应转化成诸如葡萄酒，啤酒及其它产物的其它产品。随着生物工艺学的出现，开始在分子水平进行许多这些转化，因此可以产生诸如蛋白及其衍生物的其它种类的原料，强有力地促进了制药工业合成人类生存的必需药品，诸如胰岛素，生长激素等。不久以前，术语生物工艺学中的发酵必然是指厌氧发酵，其中微生物在缺少空气的条件下加工原料。厌氧发酵的主要产品为醇，乙醇，酒精饮料以及面包工业。随着重组DNA技术的出现，发酵罐开始用于需氧发酵加工。利用需氧发酵，微生物被用于产生诸如蛋白，通过表达给定基因产生的药用，工业用酶的其它物质，所述基因天然存在于所述微生物中，或者利用重组DNA技术被引入这些微生物中。发酵过程的一个重要工业问题是从目的终产物分离微生物。这个步骤就是纯化过程并且可以通过若干方式得以实现。纯化技术被分成两大组。第一种技术包括从诸如微生物的较大组分中分离终产物。第二种技术包括回收后的产品纯化过程。对于较大组分技术而言，一种方法是真空下利用离心或者旋转过滤，通过离心力迫使不同密度物质的加速分离，由此从微生物中分离终产物。这种技术需要昂贵的设备，需要高成本的维持费并且在操作中产生过多损耗。另一使用的方法是滗析。因为滗析是自然过程，因而进行的非常慢，诸如白兰地酒生产的过程中。此外，它可以引起早期细胞分裂，将不需要的物质投入某些步骤中，诸如葡萄酒的制造工艺。当发现目标产品在细胞内时，即还未分泌时，细胞裂解是另一种使用的技术。裂解是通过化学或者机械试剂破碎细胞膜将产物释放到培养基中进行的。吸附色谱法是另一种常用方法，虽然昂贵，对于每种目标产物而言却是高度特异性的。所有的这些方法都由于延迟获得终产物或者因为进行加工所需的工厂的高成本都是昂贵的。为了解决这些问题，人们尝试了各种方法以更强烈的发生絮凝现象(将微生物聚集成团)，以此促使所述方法去除不需要的物质。由于遗传修饰的可能性，絮凝现象可被用于各种工业目的，成为纯化目标产物的方法的一部分。条件启动子与絮凝基因的组合使发酵过程最佳化，由此在与第一个纯化阶段相连时使用被转化成产品的全部扣除物。基因是指编码肽或者蛋白的核苷酸序列。基因具有被称作启动子的非编码区，将基因细分为两类远离任一刺激物表达的组成型基因，依赖于刺激物表达的调节基因。另一方面，每一启动子具有核苷酸序列的特有特性并且根据编码部分进行定位，而且可以根据发酵培养基的组分抑制或者诱导基因表达。例如，我们可以提及构建邻近于絮凝基因的ADH启动子，所述絮凝基因在缺乏葡萄糖的条件下进行表达并在缺乏所述糖的条件下受到抑制。絮凝过程受到特异基因的控制，所述特异基因中的一些是文献中已知的，诸如来自Watari(J.Watari，Agric.Biol.Chem.Vol.55，n°6，1991--1547到1552)的FLO1，并且在一些专利中已知的，诸如专利PI 0001122-3中的Pereia(2000)以及美国申请5,585,271中的Watari(1996)。在美国申请5,585,271中，Watari是指酵母中发现的絮凝基因FLO1。Watari专利主要集中于基因，但是Watari在实施例中提及了具有启动子ADH的FLO1基因的编码区在用酿酒酵母生产啤酒中的应用。通常，这个参考文献涉及啤酒生产过程，但所述具有絮凝剂的过程存在几个缺点，诸如低发酵速度；在表面上形成浮动块而且使得在加工中的发酵以及发酵罐充气变得困难；在发酵泡沫以及结渣中损失细胞。Pereira(2000)也提交了一个专利申请(PI 0001122-3 A)，其中他也利用了具有ADH启动子的FLO1基因，只是应用到生产乙醇和葡萄酒中。所述专利主要具有3点限制i)它限于酒精发酵，ii)它限于发酵过程(不包括微生物和质粒)以及iii)它限于应用于野生型微生物。此外，在Pereira的专利(2000)中，使用FLO1基因，其对于大多数工业用酵母而言具有不完全的以及不能令人满意的絮凝标准。上述Watari(1996)提及的FLO1L以及FLO1S基因改正了这个问题，因为它们包括用于全部絮凝的更多部分。另一涉及絮凝基因的专利是Kobayashi的(美国专利5,866,374)。所述专利是指利用Lg-FLO1基因用于啤酒生产。啤酒生产是一种乙醇和厌氧发酵过程，无需使用诸如药用以及工业用酶的其它物质。此外，这个过程不涉及发酵过程末期用具有敏感启动子的基因进行条件性调节。那个过程试图通过利用完整的基因简单地阻断Lg-FLO1基因或者增加其表达加强啤酒发酵。总之，如果表达得以加强或者削弱，在整个发酵期间只有一种操作方式刚好絮凝或者从不絮凝。Oliver的专利GB 2353798也利用了由特异性启动子调节的絮凝基因。但是使用的絮凝基因是具有启动子SRB1和PSA1的PKC1。这个构建物只被用来生产啤酒。这种基因和启动子的组合及其在啤酒生产中的应用不是本专利技术的范围。专利技术概述本专利技术的目的是获得遗传修饰的微生物，其具有由启动子调节的絮凝基因，所述启动子的启动或者抑制依赖于培养基的化学成分，pH或者物理激发。由于种种原因本申请不同于如上所述作为
技术介绍
的专利。首先在于过程，因为所有上述作为
技术介绍
的专利涉及的是厌氧发酵过程，而本申请涉及的是需氧发酵过程。这种差异引起科学上和经济上有价值的出乎意料的效果。厌氧发酵过程只生产乙醇产品，通常诸如葡萄酒，乙醇和酒精饮料。需氧发酵过程可以生产其它物质例如蛋白，药物，胰岛素，疫苗，工业用酶和常用酶。这些其它物质的生产源于天然存在于所述微生物中或者通过重组DNA技术被引入所述微生物中的给定基因的表达。本专利技术也涉及厌氧发酵过程但是，在本专利技术中，我们利用絮凝基因，启动子和微生物的组合，这不同于在现有技术专利中提及的。这些差异也引起具有科学上和经济重要性的出乎意料的效果。这些絮凝基因，启动子和微生物的不同组合也已经被用于可用于厌氧和需氧发酵过程的微生物，载体，质粒和基因盒的专利申请中。本申请不仅要求方法专利而且要求遗传修饰的微生物的权利。并且还要求构建所述遗传修饰微生物所需的载体，质粒和基因盒的权利。Watari和Oliver专利要求的只是作为遗传修饰微生物的酵母。在本申请中，我们还包括细菌，藻类，原生动物，真菌和古细菌。所有的这些微生物与酵母具有非常不同的特性，例如它们不是真核生物，对它们的操作更简单，它们能够在高温下生存并且能够产生光合作用。Pereira的专利不要求微生物，载体，质粒和基因盒的权利，而是要求发酵过程的权利。优选实施方案的详细说明Watari的专利提及使用酿酒酵母菌株W204的FLO1基因和ADH启动子用于啤酒发酵。我们使用与酿酒酵母具有不本文档来自技高网...

【技术保护点】
遗传修饰的细菌，其特征在于它可以具有由启动子调节的絮凝基因，所述启动子的启动依赖于培养基的化学成分，ｐＨ或者物理激发的特征。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：马科斯戈梅斯德索萨，小阿尔维斯佩雷拉哈罗多，
申请(专利权)人：萨林巴尔有限公司，
类型：发明
国别省市：UY[乌拉圭]