用于扩增雌性乌龟雌激素受体α基因的RT‑PCR引物和方法技术

本发明专利技术公开一种用于扩增雌性乌龟雌激素受体α基因的RT‑PCR引物和方法，所述RT‑PCR引物包括SEQ ID No：1和SEQ ID No：2所示的引物对。方法包括：1)提取待扩增样品的总RNA；2)将提取的总RNA反转录成cDNA；3)采用RT‑PCR引物对cDNA进行扩增；RT‑PCR引物为上述RT‑PCR引物。本发明专利技术通过设计一组RT‑PCR引物，将待扩增样品的总RNA进行提取，再进行反转录，得到cDNA，对该cDNA用RT‑PCR引物扩增，在节约成本的前提下，即可大量地快速、准确地扩增得到雌性乌龟输卵管中的雌激素受体α基因，有效实现了对雌性乌龟雌激素受体α基因的大规模和更为直观的研究。

For the RT PCR primers and amplified the female turtle estrogen receptor alpha gene

The invention discloses a method for RT PCR primers and amplified the female turtle estrogen receptor alpha gene, the RT PCR primers including SEQ ID and SEQ No:1 ID shown by No:2 primer pairs. The method includes: 1) total RNA extracted amplified samples; 2) the extraction of total RNA reverse transcription into cDNA; 3) using RT PCR primers on cDNA were amplified; RT PCR primers for the RT PCR primer. The present invention through the design of a group of RT PCR primers, total RNA will be amplified samples were extracted, and then reverse transcription, cDNA, the cDNA RT PCR primers, under the premise of saving cost, a lot can be quickly and accurately amplified the female turtle fallopian tube in estrogen receptor alpha the effective realization of the gene, estrogen receptor alpha gene and female tortoise mass is more intuitive to study.

【技术实现步骤摘要】
用于扩增雌性乌龟雌激素受体α基因的RT-PCR引物和方法
本专利技术涉及分子生物学研究领域，具体地，涉及用于扩增雌性乌龟雌激素受体α基因的RT-PCR引物和方法。
技术介绍
乌龟(Chinemysreevesii)隶属于爬行纲、龟鳖目、淡水龟科、乌龟属。乌龟有较高的药用和营养价值，深受人们的喜爱。近几十年来，人为经济活动不断加剧，龟类赖以生存的生态环境受到严重破坏，加之对野生乌龟的过度捕捞、生境破坏、化学污染以及河流建坝导致其生活水域的片断化、岛屿化，已经使野生乌龟的数量急剧下降，野生物种有面临灭绝的危险。可见，对乌龟的野生种群保护已经迫在眉睫。随着野生种群日益稀少，乌龟的人工养殖规模却在不断扩大；自上世纪80年代以来，随着科学研究和养殖技术的不断发展，我国乌龟养殖得到了空前的发展，养殖产量居世界之首。而在乌龟育种的过程中，雌性乌龟输卵管激素的变化影响了雌雄交配后雄性乌龟的精子在雌性乌龟输卵管中的储存，为精子能够在雌性输卵管中储存提供了有利条件。因此，研究雌性乌龟输卵管激素水平的变化，可以更好的了解乌龟在养殖过程中遇到的繁殖与交配问题。而以往的报道中未曾有过关于雌性乌龟雌激素受体α基因的相关研究。
技术实现思路
针对上述现有技术，本专利技术的目的在于实现对雌性乌龟输卵管激素水平的变化的大规模研究，更为直观地观察输卵管雌激素受体α基因mRNA水平的变化的效果，从而提供一种可以快速、稳定扩增雌性乌龟输卵管雌激素受体α基因的用于扩增雌性乌龟雌激素受体α基因的RT-PCR引物和方法。为了实现上述目的，本专利技术提供了一种用于扩增雌性乌龟雌激素受体α基因的RT-PCR引物，其中，所述RT-PCR引物包括SEQIDNo：1和SEQIDNo：2所示的引物对。本专利技术还提供了一种利用RT-PCR引物扩增雌性乌龟雌激素受体α基因的方法，其中，所述方法包括：1)提取待扩增样品的总RNA；2)将步骤1)中提取的总RNA反转录成cDNA；3)采用RT-PCR引物对步骤2)中反转录的cDNA进行扩增；其中，所述RT-PCR引物为上述所述的RT-PCR引物。通过上述技术方案，本专利技术通过设计一组RT-PCR引物，先将待扩增样品的总RNA进行提取，再将上述总RNA反转录，得到cDNA，进一步地，对该cDNA采用上述RT-PCR引物进行扩增，在节约成本的前提下，即可大量地快速、准确地扩增得到雌性乌龟输卵管中的雌激素受体α基因，有效地实现了能够对雌性乌龟雌激素受体α基因的大规模和更为直观的研究。本专利技术的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。附图说明附图是用来提供对本专利技术的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本专利技术，但并不构成对本专利技术的限制。在附图中：图1是是实施例1-5和对比例1-5的扩增产物的糖凝胶电泳图；其中，泳道1和泳道6来自雌性乌龟输卵管的阴道部样品、泳道2和7来自雌性乌龟输卵管的子宫部样品、泳道3和8来自雌性乌龟输卵管的峡部样品、泳道4和9来自雌性乌龟输卵管的蛋白部样品、泳道5和10来自雌性乌龟输卵管的漏斗部样品、泳道M为分子量标记。图2a是实施例6的扩增曲线；图2b是实施例6的溶解曲线。具体实施方式以下对本专利技术的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本专利技术，并不用于限制本专利技术。在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。本专利技术提供了一种用于扩增雌性乌龟雌激素受体α基因的RT-PCR引物，其中，所述RT-PCR引物包括SEQIDNo：1和SEQIDNo：2所示的引物对。本专利技术还提供了一种利用RT-PCR引物扩增雌性乌龟雌激素受体α基因的方法，其中，所述方法包括：1)提取待扩增样品的总RNA；2)将步骤1)中提取的总RNA反转录成cDNA；3)采用RT-PCR引物对步骤2)中反转录的cDNA进行扩增；其中，所述RT-PCR引物为上述所述的RT-PCR引物。在本专利技术中，为了达到更好的PCR扩增效果，使得得到的琼脂糖凝胶电泳图更清晰可见，便于更好地确定实验结果，所述扩增过程为普通PCR扩增，且以12.5μL的PCR扩增体系为基准，每条引物的浓度分别为0.01-0.03pmol/L，cDNA模板的用量为30-80ng。其中，用于PCR扩增的聚合酶以及缓冲液可以为本领域常规使用的聚合酶和缓冲液类型。另一优选的实施方式中，所述扩增过程为RT-PCR扩增，且以20μL的RT-PCR扩增体系为基准，每条引物的浓度分别为0.01-0.05pmol/L，cDNA模板的用量为50-150ng。其中，RT-PCR扩增可以使用本领域常规使用的此类试剂盒进行操作，其用量具体的可以参照产品说明书中的详细说明。本专利技术在此不再详细赘述。一种更为优选的实施方式中，所述扩增过程为顺次进行的普通PCR扩增和RT-PCR扩增；其中，在普通PCR扩增过程中，以12.5μL的PCR扩增体系为基准，每条引物的浓度分别为0.01-0.03pmol/L，cDNA模板的用量为30-80ng；在RT-PCR扩增过程中，以20μL的RT-PCR扩增体系为基准，每条引物的浓度分别为0.01-0.05pmol/L，cDNA模板的用量为50-150ng。为了能对扩增后的产物进行更好的判定和检测，所述方法还包括取普通PCR扩增后的扩增的产物做琼脂糖凝胶电泳检测。进一步优选的实施方式中，扩增的产物的泳道中出现的条带中所含有的DNA片段的长度为220bp。扩增过程中的退火过程可以为本领域所常规使用的退火方式及返火参数，在本专利技术中，为了得到更好的扩增效果，所述扩增过程的退火温度为50-60℃，退火时间为15-25s。另外，对于普通PCR扩增和RT-PCR中的变性条件、延伸条件以及循环数等参数的设置均可以按照本领域常规的设置进行操作，本专利技术在此不再详细赘述。以下将通过实施例对本专利技术进行详细描述。以下实施例中，所述引物均由生工生物工程(上海)有限公司合成且引物浓度为5pmol/L(实施例和对比例中的引物为稀释10倍后进行使用，即实施例和对比例中的引物的浓度为0.5pmol/L)，本专利技术中使用的dNTPMix为Takara公司的市售品，使用RT-PCR的试剂盒为天根生物公司的市售品，该试剂盒的型号为SuperRealPreMixPlus(SYBRGreen)，其余所使用的化学试剂均为常规市售分析纯试剂。其中，雌性乌龟输卵管分为五个部分：阴道部、子宫部、峡部、蛋白部和漏斗部。实施例11)总RNA的提取：采用快速热酚抽提法，取100mg输卵管阴道部的组织样本，放入研磨器中充分碾碎后，置于已灭菌的2.0mL的EP管；在EP管中加入1mL的Trizol溶液，室温孵育5min使其充分裂解；离心力为12000g，4℃的条件下离心10min，取出上层水相至另一2.0mLEP管中；在EP管中加入0.2mL氯仿(二氯甲烷)和1mLTrizol溶液，轻轻摇晃15s，室温放置2min；而后置于离心力为1200本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于扩增雌性乌龟雌激素受体α基因的RT‑PCR引物，其特征在于，所述RT‑PCR引物包括SEQ ID No：1和SEQ ID No：2所示的引物对。

【技术特征摘要】
1.一种用于扩增雌性乌龟雌激素受体α基因的RT-PCR引物，其特征在于，所述RT-PCR引物包括SEQIDNo：1和SEQIDNo：2所示的引物对。2.一种利用RT-PCR引物扩增雌性乌龟雌激素受体α基因的方法，其特征在于，所述方法包括：1)提取待扩增样品的总RNA；2)将步骤1)中提取的总RNA反转录成cDNA；3)采用RT-PCR引物对步骤2)中反转录的cDNA进行扩增；其中，所述RT-PCR引物为权利要求1中所述的RT-PCR引物。3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述扩增过程为普通PCR扩增，且以12.5μL的PCR扩增体系为基准，每条引物的浓度分别为0.01-0.03pmol/L，cDNA模板的用量为30-80ng。4.根据权利要求2所述的方法，其中，所述扩增过程为RT-PCR扩增，且以20μL的RT-PCR扩增体系为基准，每条引物的浓度分别为0.0...

【专利技术属性】
技术研发人员：卜兴江，陆文康，何可欣，王湘林，
申请(专利权)人：安徽师范大学，
类型：发明
国别省市：安徽,34