一种核酸测定方法技术

本发明专利技术涉及一种核酸测定方法，该方法通过可封闭的反应容器实施，反应容器包括管状腔室以及连通管状腔室的通道；其中，第一个管状腔室内设置有样品和第一反应试剂；第n个管状腔室内设置有第n反应试剂；该方法包括：将反应容器封闭，在第一个管状腔室中进行第一组反应，第一个管状腔室中的产物通过通道传送到后一个管状腔室；前一个管状腔室的产物传送到第n个管状腔室后，在第n个管状腔室中进行第n组反应。本发明专利技术提供的核酸测定方法能够保证封闭性并且操作便捷简单。且无需使用分子探针，不依赖聚合酶外切活性并且不受靶分子长度限制。

【技术实现步骤摘要】
一种核酸测定方法
本专利技术涉及分子生物学领域，具体涉及一种核酸定性或定量测定的方法。
技术介绍
随着生物技术的发展，现代分子生物学技术或基因工程技术正被日益广泛地用到各种生物技术产业中，特别是应用到医疗诊断中。这类技术的应用，往往涉及用分子探针进行定性、定量测定。典型的核酸定量扩增反应是聚合酶链式反应，即PCR。例如，当对RNA病毒进行检测和诊断时，首先需对病毒RNA进行纯化，再将RNA进行逆转录（RT）成cDNA，然后进行cDNA定量扩增反应（RT-PCR）。可见RT-PCR是两步反应。多步反应还包括巢式PCR(nestedPCR)。巢式PCR是用一对外引物完成第一步PCR后、再用一对内引物对第一步反应的产物进行第二步反应并进行定量测定。多重PCR是在一反应体系(反应管)内含有多对引物。巢式PCR的多步反应可以与多重PCR相结合、即在巢式PCR的第一步进行多重PCR、巢式PCR的第二步分别进行多个单重定量PCR。其中，定量PCR是在DNA扩增反应中，检测每次聚合酶链反应循环后产物总量，以外参或内参为标准，通过对PCR终产物的分析或PCR过程的监测，进行PCR起始模板量的定量。巢式PCR使用两对或两对以上的PCR引物分别进行扩增反应。第一对PCR引物称外引物(对)、第二对引物称内引物(对)。由于内引物结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增产物。巢式PCR的好处在于，如果第一次扩增产生了错误片断，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。因此，巢式PCR具有非常有高的特异性和灵敏度。多重PCR是在同一PCR反应体系中加入两对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应。多重PCR能够在同一PCR反应体系中对多个基因进行分析，具有高效性。RNA单链分子可通过逆转录酶转录(RT)成为互补的DNA或称cDNA分子。cDNA可与普通DNA一样可用于PCR反应。这一过程叫做RT-PCR。上述多种PCR反应可以单独实施，也可以多种PCR反应相互结合。现有技术常常采用多个反应器分别进行多步反应，不能满足密封的要求，特别是在产品转移的过程中，产物容易造成污染。此外，现有技术中常用实时荧光定量核酸扩增检测对核酸进行定量检测，检测时需要用到荧光标记的分子探针。现有用探针进行定量的方法的缺点是探针需要有二至三个标记物，在设计、制作上成本高。该方法还需要使用具外切酶活性的聚合酶，对试剂的要求高。现有用探针进行定量的方法还要求靶分子有足够的长度，如五十碱基对以上。以上要求在许多应用情况不能被满足。现有技术中也存在使用非专一性的荧光染料对核酸进行定量测定等方法。这类荧光染料可与双链的DNA结合并产生荧光，产生的信号与DNA量成正比，但与DNA的序列无关，无法测出DNA中的特定序列。
技术实现思路
为了解决上述的问题，本专利技术的目的是提供一种保证封闭性并且操作便捷简单的核酸测定方法。进一步地，本专利技术的目的是提供无探针的、不依赖聚合酶外切活性并且不受靶分子长度限制的核酸定性或定量测定方法。为实现上述目的，本专利技术提供了一种核酸测定方法，该方法通过可封闭的反应容器实施，反应容器包括按序排列的至少两个管状腔室以及连通至少两个管状腔室的至少一个通道；其中，第一个管状腔室内设置有样品和第一反应试剂；第n个管状腔室内设置有第n反应试剂，其中n等于或大于2；该方法包括：将反应容器封闭，在第一个管状腔室中进行第一组反应，第一个管状腔室中的产物通过通道传送到后一个管状腔室；第n个管状腔室接收到前一个管状腔室的产物后，在第n个管状腔室中进行第n组反应；对所述第n个管状腔室内的产物进行检测。本专利技术采用封闭式的具有至少两个管状腔室的反应容器，并通过连通管状腔室的通道将前一个管状腔室的产物传送到后一个管状腔室，该产物在后一个管状腔室中作为底物进行反应，可以实现多步PCR反应，例如巢式PCR、RT-PCR、多重PCR或者是它们的两种或以上的组合。进一步的技术方案是，第一反应试剂包括巢式PCR的第一对引物或RT-PCR的逆转录反应引物或多重PCR的第一组引物；第n反应试剂包括巢式PCR或RT-PCR或多重PCR的第n对引物或多重PCR的第n组引物和亲和性物质。在每一步扩增反应中，可以通过由亲和性物质与产物结合形成的可检测信号来对产物进行定性、定量测定。其中，亲和性物质可以是现有的任意一种或多种能够直接与产物结合形成可检测信号的物质。与分子探针不同，亲和性物质不依赖于外切酶的活性，使得任何适用于PCR的聚合酶均可以用于本专利技术的定量测定，有利于定量反应的推广，且在反应设计时不需要给分子探针预留空间，因而不受靶分子长度的影响。本专利技术无需使用具荧光标记的分子探针进行定性或定量测定，有效降低了成本。第一反应试剂和第n反应试剂除了包括对应的引物以及可根据需要加入的亲和性物质，还包括本领域公知的其他反应试剂例如聚合酶、逆转录酶、核苷酸、缓冲液等有机或无机物质。反应试剂和样品可以在反应前通过手工或自动化方法加入到相应的管状腔室中。也可以预先将反应试剂加入反应试剂，封闭后进行保存和运输，使用时在相应的管状腔室中加入样品即可。完成样品和反应试剂的加入后，再通过物理、机械或化学方式可对反应容器进行封闭，进行酶反应。根据巢式PCR和RT-PCR原理，第一个管状腔室中可以放置有一对外引物或包括逆转录引物，第二个管状腔室中可以放置有一对内引物。如有必要，第三个管状腔室可以放入相应的引物。作定量反应时，含靶分子的样品只加入到有外引物的第一反应管中。利用该方法进行定量测量的原理是，反应进行时,第二个及其后的管状腔室产生信号的时间与在第一管状腔室内样品靶分子的数量成特定的比例关系。这是由于前一个管状腔室中的产物分子会有限地通过例如分子扩散、液体对流等方法传送到后一个管状腔室，并成为下一反应的分子底物，所传送的产物分子的量和速度与上一反应的产物量成正比。通过调节或控制反应管之间分子的传输机率，可以调节定量检测的灵敏度和反应的动态范围。进一步的技术方案是，该方法还包括对任意一个管状腔室进行温度控制，温度控制包括保持任意一个管状腔室内具有恒定的温度梯度或周期性地改变任意一个管状腔室内的温度。反应容器的温度可通过所有已知方法进行控制。反应装置的温度可以是整体均衡的、整体变化的或是不同部分之间具有温差，特别是每一反应器管可以保持有一温度梯度。温度控制方式可以是对管状腔室的特定部位恒定加热，保持管形反应器内产生恒定的温度梯度，或者是使用周期变化的温度控制，使管形反应器内产生均衡的周期性变化的温度。其效果是使得管状腔室内的分子经受不同的温度，从而满足不同的酶反应条件要求，达到实现管状腔室内核酸扩增的目的。进一步的技术方案是，温度控制包括多个管状腔室进行同步温度控制。在进行核酸定量测定时，同步控制多个管状腔室的温度，例如同步控制第二个及其后管状腔室的温度，保证第二个及其后管状腔室在在接收到前一个管状腔室传送的产物的任何时候都能够立即进行反应，从而保证反应条件一致，再通过信号检测进行定量分析。进一步的技术方案是，通道中设置有介质。进一步的技术方案是，任意一个管状腔室中反应得到的产物在通道中通过液体对流或分子扩散的方式传送至后一个管状腔室。通道中的介质可以是任何能够实现产物本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种核酸测定方法，其特征在于：所述方法通过可封闭的反应容器实施，所述反应容器包括按序排列的至少两个管状腔室以及连通所述管状腔室的至少一个通道；其中，第一个管状腔室内设置有样品和第一反应试剂，第n个管状腔室内设置有第n反应试剂，其中n等于或大于2；所述方法包括：将所述反应容器封闭，在所述第一个管状腔室中进行第一组反应，所述第一个管状腔室中的产物通过所述通道传送到后一个管状腔室；所述第n个管状腔室接收到前一个管状腔室的产物后，在所述第n个管状腔室中进行第n组反应；对所述第n个管状腔室内的产物进行检测。

【技术特征摘要】
1.一种核酸测定方法，其特征在于：所述方法通过可封闭的反应容器实施，所述反应容器包括按序排列的至少两个管状腔室以及连通所述管状腔室的至少一个通道；其中，第一个管状腔室内设置有样品和第一反应试剂，第n个管状腔室内设置有第n反应试剂，其中n等于或大于2；所述方法包括：将所述反应容器封闭，在所述第一个管状腔室中进行第一组反应，所述第一个管状腔室中的产物通过所述通道传送到后一个管状腔室；所述第n个管状腔室接收到前一个管状腔室的产物后，在所述第n个管状腔室中进行第n组反应；对所述第n个管状腔室内的产物进行检测。2.根据权利要求1所述的一种核酸测定方法，所述第一反应试剂包含巢式PCR的第一对引物或RT-PCR的逆转录反应引物或多重PCR的第一组引物；所述第n反应试剂包含巢式PCR或RT-PCR或多重PCR的第n对引物和亲和性物质。3.根据权利要求1或2所述的一种核酸测定方法，其特征在于：所述方法还包括对所述管状腔室进行温度控制，所述温度控制包括保持所述管状腔室内恒定的温度梯度或周期性地改变所述管状腔室的整体温度。4.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：苏星，吴开原，
申请(专利权)人：星源智珠海生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44