水稻籼粳分类控制基因PHR1及其应用制造技术

本发明专利技术从水稻籼稻品种９３－１１中克隆并鉴定了控制水稻籼粳分类的基因并将其命名为ＰＨＲ１。转基因功能互补实验证明ＰＨＲ１是区分水稻籼粳分类的基因。在水稻中抑制或过量表达ＰＨＲ１，得到具不同抗病虫害能力的转基因水稻，表明可以利用基因工程技术调控该基因从而调节植物抗性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及植物基因工程领域，更具体地，本专利技术涉及水稻酚染色反应控制基因PHR1编码的蛋白质及其功能类似物，编码其的核苷酸序列，含有该核苷酸的载体和含有该载体的宿主细胞；另外，本专利技术还涉及控制植物酚染色反应的方法和改良植物抗病虫育种的方法。
技术介绍
在栽培稻的漫长进化历史中，产生了大约80000-100000个栽培种。这些栽培种根据相互间杂交后育性的不同被分为两类，一类为籼稻(Indica)，另一类为粳稻(Japonica)。然而通过育性进行分类，工作量大而不易被使用。1962年，Oka经过大量的田间观察发现，通过考察栽培种的稃毛长度(A)、耐冷性(B)、对酚溶液的颜色反应(C)和对次氯酸钾抗性(D)，以及利用公式X＝-D+0.75B-0.22A+0.86C可将栽培稻精确的进行分类。特别是酚反应(将种子浸在2％的苯酚溶液3-5天，籼稻被染成黑褐色，而粳稻则不能被染色)，只通过这一个指标，90％以上的栽培稻可进行正确的籼粳间分类。因此它对于研究水稻的起源和进化具有重要的作用。此外，在水稻杂交育种的实践中发现，籼/粳交比籼/籼或粳/粳交提高30％的产量，因此有效的进行籼粳分类，将对于指导育种实践具有重要的意义。鉴于酚反应这一性状在研究水稻分类、进化以及水稻育种上的重要意义，其反应特性吸引了众多科研工作者的兴趣，中日学者在这方面做了大量的研究。Takahashi发现，将叶、茎、叶耳、茎节以及种子浸在2％的酚溶液中时，只有种子能被染色，而其它部位则不能被染色。根据小麦的酚颜色反应，籼稻种子被染色的机理与两个反应有关，第一个反应是酚的芳香环被进一步羟化，而第二个反应酚能被氧化为相应的醌(多酚氧化酶)。而粳稻种子不能被染色则可能与不能羟化酚的芳香环有关，例如缺少羟化酶或电子供体。因此，阐明酚染色反应的生物化学和分子机理，对提示水稻籼粳分类以及研究水稻进化遗传学具有重要的意义。此外，多酚氧化酶(PPO)对于植物防御病虫的侵害也具有重要作用。Constabel等通过检测伤害及毛虫侵害后杨树中PPO的表达量，发现无论是在伤害后还是虫食后，杨树PPO的表达量与对照相比均显著提高。在番茄、马铃薯等植物中也得到了相似的结果。通过过量表达马铃薯PPO，转基因植株与对照相比表现出对细菌病害P.syringae具有较强的抗病性。进一步证实了多酚氧化酶在植物的抗病虫性中具有重要作用。自从Oka发现酚反应可以做为籼粳分类的指标后，Takahashi和Kinoshita等根据经典遗传学的研究，发现酚颜色反应是由一对基因控制，并将酚反应基因(PHR1)定位于第四染色体上，Saito等通过分子标记法将PHR1基因进一步定位于第四染色体的长臂上，随后，Shao-Yang LIN进一步将其定位于两个RFLP标记Kyy3和V17之间。但至今未见克隆该基因的报道。
技术实现思路
针对上述研究背景，本专利技术人通过深入研究，选择能被染色的籼稻和不能被染色的粳稻品种，运用图位克隆技术首先克隆了PHR1基因，该基因编码一种多酚氧化酶(SEQ ID NO2)，经过序列分析，其属于多酚氧化酶(PPO)家族，与小麦PPO(SEQ ID NO4，AY515506)的同源性为64％，直接参与将底物酚氧化成醌，并进行了该基因的功能验证。本专利技术的一个目的是提供一种水稻酚染色反应控制基因PHR1编码的蛋白质，其具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，或者该氨基酸序列通过一个或多个氨基酸的替换、缺失或插入而获得的，仍具有水稻酚染色反应控制功能的功能类似物。所述水稻酚染色反应控制基因PHR1具有SEQ IDNO1所示的核苷酸序列。本专利技术另一个目的是提供一种核苷酸序列，其编码SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，或者该氨基酸序列通过一个或多个氨基酸的替换、缺失或插入而获得的，仍具有水稻酚染色反应控制功能的功能类似物。本专利技术还有一个目的是提供一种包含核苷酸序列的载体，所述核苷酸序列编码SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，或者该氨基酸序列通过一个或多个氨基酸的替换、缺失或插入而获得的，仍具有水稻酚染色反应控制功能的功能类似物。在一个优选实施方案中，该载体为pCAMPHR1。本专利技术另外的目的是提供一种含有载体的宿主细胞，所述载体含有核苷酸序列，该核苷酸序列编码SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，或者该氨基酸序列通过一个或多个氨基酸的替换、缺失或插入而获得的，仍具有水稻酚染色反应控制功能的功能类似物。在优选实施方案中，该宿主细胞是大肠杆菌细胞、农杆菌细胞或植物细胞。本专利技术还提供一种控制植物酚染色反应的方法，其包括i)用上述载体转化植物细胞；和ii)将转化的植物细胞培育成植株。在一个优选实施方案中，该植物是水稻。本专利技术进一步提供一种改良植物抗病虫育种的方法，其包括用上述载体转化植物细胞；和将转化的植物细胞培育成植株。在一个优选实施方案中，将上述载体通过农杆菌介导法或基因枪法转化植物细胞。优选植物为水稻。为了实现上述目的，本专利技术的一种优选实施方式包含以下步骤一、水稻种子酚反应的遗传分析本专利技术所采用的水稻品种为能被苯酚染色的籼稻品种(Indica)“明恢63”(中国水稻研究所)和不能染色的粳稻品种(Japonica)“春江06”(中国水稻研究所)，二品种杂交得F1代自交产生F2代，F2代植株所结种子用于苯酚颜色反应试验，明恢63和春江06分别作为正、负对照，如图1所示(A为明恢63，B为春江06)。实验数据证明，水稻酚反应这一性状符合单基因控制遗传规律。二、图位克隆控制水稻酚反应的PHR1基因PHR1基因的初步定位为了分离PHR1基因，本专利技术首先建立了一个大的多态性高的定位群体，由明恢63(籼稻)与春江06品种(粳稻)杂交而形成的F2群体，再通过图位克隆的方法，并利用已公布的水稻第四染色体SSR(SimpleSequence Repeat)等分子标记对PHR1位点进行初步定位，将其初步定位在第4染色体长臂，并介于Kyy03和V17两个RFLP(Restriction FragmentLength Polymorphism)标记之间，见图2。PHR1基因的精细定位及物理定位通过已测序的PHR1位点区域的BAC(Bacterial Artificial Chromosome)序列，建立PAC克隆重叠群。利用了S2970，S6660，P80，S6650和6444等5个STS(Sequence-tagged Sites)标记(序列见表1)和发展了P168，S6669和S2988等3个新的SSR标记(序列见表1)，进行精细定位，最终将PHR1定位于PAC克隆AL606645上SSR标记P80与P168之间，88kb的范围之内(图3)。通过分析此区段的开放阅读框(ORF)推测候选基因。PHR1基因的鉴定和功能分析进行功能互补的转基因研究。将PHR1基因构建到常规植物表达载体并转化到不能进行酚反应的粳稻品种Nipponbare(中国水稻研究所)中，结果转基因水稻的种子能够进行酚反应(见图5)；证明了本专利技术正确克隆了PHR1基因，氨基酸序列分析表明PHR1基因可能编码一种多酚氧化酶。三、PHR1基因在水稻中的表达通过转基因技术将PHR1基因以正义(Sense)形式转入水稻中，获得表型与反义本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种水稻酚染色反应控制基因ＰＨＲ１编码的蛋白质，其具有ＳＥＱＩＤＮＯ：２所示的氨基酸序列，或者该氨基酸序列通过一个或多个氨基酸的替换、缺失或插入而获得的，仍具有水稻酚染色反应控制功能的功能类似物。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李家洋，钱前，于彦春，曾大力，周奕华，
申请(专利权)人：中国科学院遗传与发育生物学研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]