小麦脱水应答转录因子DREB基因cDNA序列制造技术

本发明专利技术公开了小麦脱水应答转录因子ＤＲＥＢ基因ｃＤＮＡ序列，属于农业生物基因工程领域。该基因用小麦基因组ＤＮＡ及同源克隆的方法获得，属于小麦中脱水应答因子ＣＢＦ４家族中的一个新成员。该基因ｃＤＮＡ序列全长９３６ｂｐ，有一个长１３０ｂｐ的５’ＵＴＲ和长８９ｂｐ的３’ＵＴＲ以及长７１７ｂｐ的开放阅读框，其编码框为第１３１－８４７位核苷酸，编码一个长２３８ａａ多肽链。该发明专利技术利用农杆菌介导的基因转化法，将克隆到的基因编码序列构建到植物表达载体ｐＲＯＫⅡ中，并转化到拟南芥，转化了该基因的拟南芥抗盐性和抗寒性明显提高。本发明专利技术从克隆转录因子基因入手，进而实行转基因研究，为提高小麦抗逆性提供了有效的方法和途径。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于农业生物基因工程领域，涉及栽培小麦脱水应答转录因子DREB基因cDNA编码序列。
技术介绍
DREB(Dehydration Responsive Element Binding)基因元件的发现是近年来植物抗逆研究方面最具突破性的进展。Liu Qiang等(Plant Cell，1998，101391~1406)从拟南芥中分离到5个AP2/EREBP类转录因子基因，分属两个亚家族，分别命名为DREB1A、DREB1B、DREB1C和DREB2A、DREB2B。后来发现与Stockinger等(1997)分离到的CBF(C-repeat/DRE-Binding Factor)家族有对应关系，DREB1A即是CBF3，DREB1B即是CBF1，DREB1C即是CBF2。有证据表明CBF1，CBF2，CFB3作为一个基因簇位于拟南芥的第IV号染色体上，CBF2和CBF3分别存在于CBF1基因上游的3Kb和7Kb处。比较CBF1，CBF2，CBF3的核苷酸序列时，可以发现它们的阅读框(ORF)中没有内含子插入(Joaquin Medina等，1999)。我们使用BLAST程序在Genbank数据库中搜索到的目前已知的所有DREB转录因子家族成员，发现与抗逆特性相关的转录因子的研究，主要集中在拟南芥、大麦、黑麦、水稻、油菜等植物上，对小麦转录因子基因的研究则很少，尤其尚未见对小麦DREB家族成员研究的报道。植物对非生物胁迫逆境抗性性状是一种数量性状，是由多种基因控制的综合反应，通过单基因改良的方式很难提高植物的抗逆性，尤其对基因组来源复杂的栽培小麦的抗逆性研究更为困难。由于一个DREB转录因子可以调控多个与植物干旱、高盐及低温耐受性有关的功能基因的表达，从而提高植物对环境胁迫的整体抗性，因此对小麦的抗逆性研究，从克隆转录因子基因入手，进而实行转基因研究，是提高小麦抗逆性更为有效的方法和途径。
技术实现思路
一种小麦脱水应答转录因子DREB基因cDNA序列，属于小麦CBF4基因家族的一个成员，cDNA全长936bp；该基因有一个长130bp的5’UTR和长89bp的3’UTR以及长717bp的开放阅读框，其编码框为第131-847位核苷酸，编码一个长238aa多肽链。该基因的全长cDNA序列为5’TGAGCACCGGGGACCCTACATGGGACTGAAGGGGTAGGGAAAAAACACCATCGTTCAAGGTGCTCAACCCTCTTCACTAGCTTTCGAATCAGATGGACGTCGCCGACGCTGCCTCCAAGTCCCGGCCAGC AGCAGGGTCACAGGACGGTGTCGTGGGATCCCCCAAAGCGGCCGGCGGGGCGGACCAAGTTCCACGAGACGCGCCACCCGCTGTACCGGGGCGTTCGGCGCCGTGGCCGGGTCGGGCAGTGGGTGTGCGAGGTGCGCGTGCGCGGCACCAATGAGACAAGGCTCTGGCTCGGCACCTTCCACACCGCCGAGATGGCGGCGCGAGCGCAC GACTCCGCCTCGCTCGCTCTCTCCGGAAGCGCCGCCTGCCTCAACTTCGCCGACTCCGCATGGCGGATGCTGCCCGTGCTTGCGGCCGGATCGTTCGGCTTCGGCAGCGCGCGGGAGATCAAGCTTGCCGTCGCCGTTGCCGTCGTTGCGTTCCAGCAGCAGCAGATTATTCTTCCAGTCGCGTGTCCAACGGTGGAGGCGGCCGCCAGCCCGAGCAACTCTCTGTTTTACATGTCGTCCGTCGACTTGCTGGAGCTCGACGAGGAGCAGTGGTTTGGCGGCATGGACGCTGGGTCGTACTACGAGAGCTTGGCGCAGGGGATGCTCGTGGCGCCGCCGGACGACAGAGCGAGGCGGGAGGACGCCGAGCAGACCGGCGTCGAGACACCGACGCCGTTATGGAGCTATTTGTTTGACTAATTCAGCACGCAGTGTAAAGTTGTCGATAGTTGCGTTGTGTTCTTCCCAATTTGGGAACGAACAGAGTAGGCAGTTTTTTTTT AGGTTGTAGTAGGCAGTTTGAAGTTCCCGGTTTCTACTTTTGTGAGAAATGGACCCTAGATTGCTTATCGCAAAAAAAAAAAAAAAAAA3’(SEQ ID NO.1)需要说明的是以上序列中的阴影部分，分别为基因的起始密码子和终止密码子，下画线部分为编码区；717bp长的基因编码区，编码一个长238aa多肽链，多肽链的氨基酸序列为MSRVTGRCRGIPQSGRRGGPSSTRRATRCTGAFGAVAGSGSGCARCACAAPMRQGSGSAPSTPPRWRRERTTPPRSLSPEAPPASTSPTPHGGCCPCLRPDRSASAARGRSSLPSPLPSLRSSSSRLFFQSRVQRWRRPPARATPSTCWSSTRSSGLAALCFTCRWTLGRTTRAWRRGCSWRRRTTERGGRTPSRPASRHRRRYGAICLTNSARSVKLSIVALCSSQFGNEQSRQFFF(SEQ ID NO.2)小麦脱水应答转录因子DREB基因cDNA序列在改善抗逆特性方面的应用，利用农杆菌介导的基因转化法将克隆到的基因编码序列构建到植物表达载体pROKII中，并转化到拟南芥，该基因明显改善了拟南芥的抗盐性和抗寒性。其具体制备方法如下有文献报道(Joaquin Medina，1999)，DREB基因中不含内含子。本专利技术根据已发表的黑麦DREB基因的保守序列设计相互重叠的两对引物，利用同源克隆的方法，以小麦基因组DNA为模板，经PCR扩增，首先获得292bp(Wheat Jing411292bp，WtJ292)和161bp(Wheat Jing411 161bp，WtJ161)两片段，克隆并测序，BLASTn比对后发现WtJ292与一个大麦DREB基因有90％的同源性。WtJ161与一个大麦DREB基因有85％的同源性。将两片段拼接(Wheat Jing411 426bp，WtJ426)，再根据该拼接片段序列设计引物，以4℃冷胁迫2小时的小麦黄化苗总体RNA为模板，做cDNA3’末端和5’末端快速扩增，获得了该基因的3’端和5’端，该基因全长cDNA长936bp。BLASTn和BLASTx综合分析，发现该基因与大麦、小麦、水稻、黑麦以及拟南芥等多个CBF基因的同源性均在百分之八十以上，同源性最高的为大麦的CBF4D基因，核苷酸(AY785852.1)同源性为89％，氨基酸(AAX23696.1)的同源性为83％。另外还与大麦CBF4A核苷酸(AY785849.1)同源性为88％，氨基酸(AAX28949.1)的同源性为82％；大麦CBF4B核苷酸(AY785848.1)同源性为88％，氨基酸(AAX28950.1)同源性为82％；与小麦的CBF9(AY785905.1)同源性虽为88％，但氨基酸本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种小麦脱水应答转录因子ＤＲＥＢ基因ｃＤＮＡ序列，其特征在于属于小麦ＣＢＦ４基因家族的一个成员，ｃＤＮＡ全长９３６ｂｐ；该基因有一个长１３０ｂｐ的５’ＵＴＲ和长８９ｂｐ的３’ＵＴＲ以及长７１７ｂｐ的开放阅读框，其编码框为第１３１－８４７位核苷酸，编码一个长２３８ａａ多肽链；ＤＲＥＢ基因的全长ｃＤＮＡ序列为：５’ＴＧＡＧＣＡＣＣＧＧＧＧＡＣＣＣＴＡＣＡＴＧＧＧＡＣＴＧＡＡＧＧＧＧＴＡＧＧＧＡＡＡＡＡＡＣＡＣＣＡＴＣＧＴＴＣＡＡＧＧＴＧＣＴＣＡＡＣＣＣＴＣＴＴＣＡ ＣＴＡＧＣＴＴＴＣＧＡＡＴＣＡＧＡＴＧＧＡＣＧＴＣＧＣＣＧＡＣＧＣＴＧＣＣＴＣＣＡＡＧＴＣＣＣＧＧＣＣＡＧＣＡＴＧＡＧＣＡＧＧＧＴＣＡＣＡＧＧＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＧＡＴＣＣＣＣＣＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＡＣ ＣＡＡＧＴＴＣＣＡＣＧＡＧＡＣＧＣＧＣＣＡＣＣＣＧＣＴＧＴＡＣＣＧＧＧＧＣＧＴＴＣＧＧＣＧＣＣＧＴＧＧＣＣＧＧＧＴＣＧＧＧＣＡＧＴＧＧＧＴＧＴＧＣＧＡＧＧＴＧＣＧＣＧＴＧＣＧＣＧＧＣＡＣＣＡＡＴＧＡＧＡＣＡＡＧＧＣＴＣＴＧＧ ＣＴＣＧＧＣＡＣＣＴＴＣＣＡＣＡＣＣＧＣＣＧＡＧＡＴＧＧＣＧＧＣＧＣＧＡＧＣＧＣＡＣＧＡＣＴＣＣＧＣＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＴＣＴＣＣＧＧＡＡＧＣＧＣＣＧＣＣＴＧＣＣＴＣＡＡＣＴＴＣＧＣＣＧＡＣＴＣＣＧＣＡＴＧＧＣＧＧＡＴＧＣ ＴＧＣＣＣＧＴＧＣＴＴＧＣＧＧＣＣＧＧＡＴＣＧＴＴＣＧＧＣＴＴＣＧＧＣＡＧＣＧＣＧＣＧＧＧＡ　ＧＡＴＣＡＡＧＣＴＴＧＣＣＧＴＣＧＣＣＧＴＴＧＣＣＧＴＣＧＴＴＧＣＧＴＴＣＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＡＴＴＡＴＴＣＴＴＣＣＡＧＴＣＧ ＣＧＴＧＴＣＣＡＡＣＧＧＴＧＧＡＧＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＧＣＣＣＧＡＧＣＡＡＣＴＣＴＣＴＧＴＴＴＴＡＣＡＴＧＴＣＧＴＣＣＧＴＣＧＡＣＴＴＧＣＴＧＧＡＧＣＴＣＧＡＣＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＧＧＴＴＴＧＧＣＧＧＣＡＴＧＧＡＣＧＣＴＧＧ ＧＴＣＧＴＡＣＴＡＣＧＡＧＡＧＣＴＴＧＧＣＧＣＡＧＧＧＧＡＴＧＣＴＣＧＴＧＧＣＧＣＣＧＣＣＧＧＡＣＧＡＣＡＧＡＧＣＧＡＧＧＣＧＧＧＡＧＧＡＣＧＣＣＧＡＧＣＡＧＡＣＣＧＧＣＧＴＣＧＡＧＡＣＡＣＣＧＡＣＧＣＣＧＴＴＡＴＧＧＡＧＣ ＴＡＴＴＴＧＴＴＴＧＡＣＴＡＡＴＴＣＡＧＣＡＣＧＣＡＧＴＧＴＡＡＡＧＴＴＧＴＣＧＡＴＡＧＴＴＧＣＧＴＴＧＴＧＴＴＣＴＴＣＣＣＡ...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王振英，孔照胜，王少峡，薛志娟，彭永康，
申请(专利权)人：天津师范大学，
类型：发明
国别省市：12[中国|天津]