环境生物工程领域中的一株降解多氯联苯的兼性厌氧菌及获得方法，包括：从多氯联苯的污染点取样，经过初筛、分离、纯化菌株，再经筛选及强化驯化ＰＣＢｓ降解菌株的步骤，获得了一株高效降解ＰＣＢｓ的新菌株Ｒａｏｕｌｔｅｌｌａ ｔｅｒｒｉｇｅｎａ ＬＹ４０２。该菌株为兼性厌氧菌，能够利用生物表面活性剂蔗糖脂为碳源快速降解２，３′，４，４′－四氯联苯；在好氧情况下对Ａｒｏｃｌｏｒ１２４２的７０小时降解率为９８．０２～９９．１５％；在兼性厌氧情况下，对土壤中Ａｒｏｃｌｏｒ１２６０的８天降解率为９６．５５％。优点：①能够降解不同取代位点的ＰＣＢｓ；②能够利用蔗糖脂高效降解ＰＣＢｓ，无二次污染。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术特别涉及到从多氯联苯(polychlorinated biphenyls，PCBs)的污染点筛选、分离、纯化并强化驯化出高效降解PCBs的新菌株Raoultella terrigenaLY402，及对该菌株性能的研究，属于环境生物工程领域。
技术介绍
近几十年来，化学工业的快速发展使得大量的有害废物被排放到自然环境中，其中，12类有机污染物因为稳定性强、难以自然生物降解、对人体和环境危害巨大而被联合国环境规划署列为优先控制的持久性有毒有机污染物。多氯联苯(polychlorinated biphenyls，PCBs)是其中最具有代表性的一类，也被称为二恶英(dioxins)类似化合物。PCBs是一组由一个或多个氯原子取代联苯分子中的氢原子而形成的具有广泛应用价值的氯代芳香族化合物，其结构复杂，有209种同系物。PCBs具有优良的稳定性、热传导性和绝缘性，曾在世界范围内被大量生产，主要被作为变压器油、添加剂等应用在电力、化工等行业，80年代中期被停止生产。对PCBs的毒理研究表明，少量的PCBs即可对人产生严重的致癌、致畸作用，极强的稳定性也使其很难被自然界中的微生物降解，会在自然界中长期存在，在动植物体内富集并通过食物链进入人体，对环境和人类健康危害巨大。近十几年来，有关PCBs污染土壤修复方法的研究一直是学术界的研究热点和难点。物理的、化学的及生物的方法均被采用研究PCBs污染点的修复。其中，生物修复方法因具备修复费用低、能彻底清除污染物、不会对环境造成二次污染而被认为是最有前景的修复手段。目前对PCBs的生物修复手段主要通过优势微生物的生物降解实现。微生物降解主要有好氧降解和厌氧降解两种方式。好氧降解是通过开环破坏PCBs，而厌氧降解则是从高氯取代的同系物中通过催化还原移走氯，即把高氯代同系物变成低氯代同系物，通过改变同系物的分布来减少氯取代的数量和位点、降低混合物的毒性而使混合物更易被好氧微生物降解。迄今为止，PCBs好氧降解和厌氧降解已经有20余年的研究历程，已经从污染点筛选出了40余种PCBs好氧降解菌株，对每种菌株的PCBs降解性能进行了详细的研究，除了少数几株菌能够降解6个氯以下的PCBs外，其余只能降解低于4氯的PCBs。其中，降解效果最好的是假单胞菌(Pseudomonas sp.)LB400。在美国通用电子公司(General Electric Company GE)的两篇专利U.S.Pat.No.4,843,009和5,009,999中，详细描述了Pseudomonas sp.LB400的筛选、分离和纯化方法，并实验证实该菌株对低氯取代PCBs占主体的Aroclor 1242(主要为2、3、4氯取代的PCBs)和Aroclor 1254(主要为3、4、5氯取代的PCBs)有较快的降解速率，但对邻位或2，3位点或3，4位点被氯取代的PCBs不具有降解能力，专利中未对高于6氯取代的PCBs进行降解实验，也未对含有大量土著菌的实际土壤进行降解实验。1987年，美国通用电子公司在纽约附近进行了首次PCBs生物修复的区域放大实验，污染地PCBs的初始浓度范围从50到525ppm。修复方法为将假单胞菌属的LB400菌株投放到污染地，监测PCBs浓度的变化，发现在4个月内，PCBs的浓度只降低了约20％，其降解速率远低于实验室水平。研究过程中发现，在实际PCBs的污染点，高氯取代的PCBs同系物毒性更大，更难被降解。目前，PCBs污染点的生物修复还存在诸多问题没有解决，因而阻碍了生物修复技术在实际污染点的应用。存在的主要问题如下(1)目前发现的降解菌株只能降解部分PCBs，邻位或2，3位点或3，4位点被氯取代的PCBs以及6氯以上取代的高毒性PCBs不能被微生物有效降解；(2)在好氧降解中需要加入联苯作为诱导底物，联苯本身也是一种有毒的有机化合物，其加入会对环境造成二次污染，所以在实际的降解过程中要尽可能解除联苯的添加，必须获得不需要联苯作为底物仍能降解PCBs的菌株；(3)在实际的PCBs污染点，由于杂菌等环境因素的影响，优势微生物数量和活性受到很大影响，对PCBs的降解效率显著降低，在实际土壤体系中达到明显的降解一般需要几个月甚至几年的时间；因此，筛选能够降解所有PCB的同系物，特别是降解6氯以上的高毒性PCB同系物的微生物菌株，提高其在实际PCBs污染点的生存能力和降解速率，降低二次污染，是微生物修复技术迈向实用化的关键。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一株降解多氯联苯的兼性厌氧菌株及获得方法，以克服现有技术中存在的(1)邻位或2，3位点或3，4位点被氯取代的以及6氯以上取代的高毒性PCBs不能被微生物有效降解；(2)联苯作为诱导底物会对环境造成二次污染；(3)在实际污染点降解效率低的不足。特提出本专利技术的技术解决方案。本专利技术的基本构思是首先从PCBs污染点大量筛选、分离、纯化能够降解PCBs的菌株，从中进一步筛选出高效菌株，以解决邻位或2，3位点或3，4位点被氯取代的以及6氯以上取代的高毒性PCBs不能被有效生物降解的问题。目前，在环境体系中进行有效的筛选，进而进行合理的驯化是获得高效PCBs降解菌株的有效途经。从环境中筛选PCBs降解菌的理论基础是虽然在自然环境中几乎不存在能够降解PCBs的微生物，但自然界中的微生物尤其是细菌较易发生变异，长期在PCBs存在的环境中生存，基因会发生某些突变，使得某些微生物能够利用或部分利用PCBs，如果将其纯化并在较高的PCBs浓度下进一步驯化、强化，将显著提高其降解能力。因此，在筛选、分离纯化降解菌株方面，采用以联苯为碳源的培养基进行初步筛选，用稀释及平板划线法分离纯化菌株，以对2，3′，4，4′-四氯联苯的降解速率为标准进一步筛选纯菌株，利用联苯培养基中外加PCBs混合物的方法对筛选出的菌株进行反复的强化驯化以稳定菌株性状，提高对PCBs的降解效率。其次，为了避免联苯作为诱导底物对环境造成二次污染，本专利技术的基本构思是以能够促进降解菌的生长并能提高PCBs的降解速率为准则筛选能够取代联苯的环境友好碳源。最后，为了确定降解菌在PCBs实际污染点的降解能力和范围，分别采用水相体系和土壤相体系对低氯和高氯取代的PCBs进行降解实验，并在降解体系中加入取代联苯的碳源，以提高在实际污染点的生物修复效率。本专利技术所提出的，包括从多氯联苯的污染点取样，经过初筛、分离、纯化菌株，再经筛选及强化驯化PCBs降解菌株的步骤，获得了一株高效降解PCBs的新菌株，其特征在于 a)经中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC鉴定，该菌株的种属为Raoultella terrigena，别名为Klebsiella terrigena，命名为LY402，保藏中心编号为1420，该菌株是兼性厌氧菌，能够在温度-20℃～60℃、pH值为3.0～12.0的环境中存活，适宜生长的温度为20℃～40℃，适宜生长的pH值为5.0～10.0；b)该菌株Raoultella terrigena LY402的获得方法，是第一步采用1～3g/L联苯为碳源的培养基进行初筛，利用第二步稀释及平板划线法分离纯化菌株，通过第三步检测不同菌株对2mg/L的2，3′，4，4′-四本文档来自技高网...
【技术保护点】
一株降解多氯联苯的兼性厌氧菌及获得方法，包括：从多氯联苯的污染点取样，经过初筛、分离、纯化菌株，再经筛选及强化驯化ＰＣＢｓ降解菌株的步骤，获得了一株降解ＰＣＢｓ的新菌株，其特征在于：ａ）经中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心ＣＧＭＣＣ鉴定，该菌株的种属为Ｒａｏｕｌｔｅｌｌａｔｅｒｒｉｇｅｎａ，别名为Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｔｅｒｒｉｇｅｎａ，命名为ＬＹ４０２，保藏中心编号为１４２０，该菌株是兼性厌氧菌，能够在温度－２０℃～６０℃、ｐＨ值为３．０～１２．０的环境中存活，适宜生长的温度为２０℃～４０℃，ｐＨ值为５．０～１０．０；ｂ）该菌株ＲａｏｕｌｔｅｌｌａｔｅｒｒｉｇｅｎａＬＹ４０２的获得方法，是第一步采用１～３ｇ／Ｌ联苯为碳源的培养基进行初筛，利用第二步稀释及平板划线法分离纯化菌株，通过第三步检测不同菌株对２ｍｇ／Ｌ的２，３′，４，４′－四氯联苯的降解能力进一步筛选，得到该ＰＣＢｓ降解菌株，该菌株对２ｍｇ／Ｌ的２，３′，４，４′－四氯联苯的３～５天降解率为５９．２６％～６４．６９％；为了进一步提高该菌株对ＰＣＢｓ的降解能力，第四步采用了２ｇ／Ｌ联苯及ＰＣＢｓ混合物为碳源进行强化驯化，其中，ＰＣＢｓ是商用Ａｒｏｃｌｏｒ１２４２与Ａｒｏｃｌｏｒ１２６０的等量混合物，含量为１０－５０ｍｇ／Ｌ，驯化时间为２－３个月，２ｍｇ／Ｌ的２，３′，４，４′－四氯联苯的３天降解率提高到８６．７％，提高了２５％以上。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：贾凌云，文成玉，蒋彩平，杨凤林，
申请(专利权)人：大连理工大学，
类型：发明
国别省市：91[中国|大连]
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