厌氧产电菌分离及电化学活性鉴定方法技术

一种厌氧产电菌的分离及电化学活性鉴定方法，它涉及微生物分离及检验方法。它解决了产电菌分离中整套滚管设备购置困难、培养基营养成分高温灭菌时失活、厌氧滚管操作稀释倍数选择不当、分离时严格厌氧条件较难达到及纯菌的电化学活性的检验周期长等问题。本发明专利技术分离方法：亨盖特滚管替代装置廉价易得，操作简单；培养基配制方法可有效避免营养成分失活，营养丰富，产电菌活性强；选择的滚管稀释倍数能高效获得单一菌落，缩短了分离周期；采用直接在厌氧瓶中煮沸和抽真空的方法除氧，避免了传统除氧方法对培养基体系平衡的影响；产电菌电化学活性采用循环伏安法进行检验，减少了杂菌污染的影响，检验周期短。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】一种厌氧产电菌的分离及电化学活性鉴定方法，它涉及微生物分离及检验方法。它解决了产电菌分离中整套滚管设备购置困难、培养基营养成分高温灭菌时失活、厌氧滚管操作稀释倍数选择不当、分离时严格厌氧条件较难达到及纯菌的电化学活性的检验周期长等问题。本专利技术分离方法：亨盖特滚管替代装置廉价易得，操作简单；培养基配制方法可有效避免营养成分失活，营养丰富，产电菌活性强；选择的滚管稀释倍数能高效获得单一菌落，缩短了分离周期；采用直接在厌氧瓶中煮沸和抽真空的方法除氧，避免了传统除氧方法对培养基体系平衡的影响；产电菌电化学活性采用循环伏安法进行检验，减少了杂菌污染的影响，检验周期短。【专利说明】
本专利技术涉及厌氧产电菌分离及电化学活性检验方法。
技术介绍
微生物燃料电池(MFC)是一种利用具有产电活性的微生物将有机质中的化学能转化成电能的装置。产电菌分解有机底物，释放出电子和质子，传输到阴极从而形成电流和水。目前对MFC的研究重点集中在以下四个方面:反应器的设计；底物的选择；电极材料的优化；微生物的分离。MFC挂膜启动的本质为产电菌和其他种群微生物竞争，在电极表面附着形成生物膜的过程。微生物在降解有机物和转移电子方面发挥重要作用，电活性高的菌株，转化有机底物速率快，能量转化效率高，输出功率密度也较高。因此，产电菌的种类及能否形成优势种群是MFC成功启动的关键因素，高效产电菌的获得及对其产电机理的研究将推动MFC的研究进展。 目前，已经从MFC中分离出的产电微生物主要有:地杆菌(Geobacteracae)、希瓦氏菌(Shewanella)、假单抱菌(Pseudomonas)、梭菌属(Clostridium)、脱硫单菌(Desulfuromonas)和铁还原红育菌(Rhodofoferax ferrireducens)等。虽然产电菌的分离工作在近年得到了较大发展，但还存在一定的局限性，因为大多数严格厌氧产电菌对氧气的条件要求苛刻，而保持绝对厌氧条件比较困难，而且不经济。所以，目前在实验室能纯培养出的厌氧产电菌种类非常有限，而即使运用分离培养技术得到的菌种也较难进入培养状态，分离纯化技术的局限性限制了人们对产电菌的认识与调控。 亨盖特滚管技术是1950年由美国微生物学家亨盖提出并应用于瘤胃厌氧微生物研究的一种厌氧培养技术。这种厌氧培养技术经过不断改进而日趋完善，多年来的实践证明，它是目前应用最为广泛、研究严格厌氧菌的一种非常有效的技术。本专利技术中将亨盖特滚管技术应用于产电菌的分离，但是，由于该套技术在操作装置、操作步骤等方面还存在一定缺陷，还需根据实际需要进行必要的改良。 此外，培养基对菌株的选择起重要作用，其对产电菌的分离有决定性的影响，是产电菌分离的基础，通过改变培养基的配制方法或添加特定的成分，是实现特异性产电菌分离纯化的主要途径。 现有厌氧产电菌的分离和电化学活性的鉴定方法，主要还存在以下几个问题: (I)亨盖特滚管分离整套装置中的滚管机和定量加样器价格昂贵，实际试验中难以获得实用易操作的的成套设备。 (2)现有产电菌分离所采用的培养基，虽然基本组成营养丰富，但由于配制步骤不正确或配比不合理，不能充分发挥每种营养成分的功能，而不利于产电菌生长，同时获得的菌株电活性不强。 (3)滚管操作的稀释倍数选择时，由于不同菌落大小不同，生长速率也不同，若滚管采用的稀释倍数太小，则形成菌落密而小，不易挑出单菌落；若采用的稀释倍数太大，则很可能难找到生长完整的菌落。 ( 4 ) 一般分离出的产电菌为好氧或者兼性厌氧，而严格厌氧产电菌分离成功较少，一方面由于严格厌氧菌生长周期较长，长期的严格厌氧条件难以达到；另一方面由于在采用煮沸法或加入还原剂的方法去除氧气的过程中，由于水分蒸发和还原剂酸性问题，导致培养基PH条件难以控制。 (5)由于滚管操作和扩大培养需反复进行多次才能分离出纯菌株，纯化过程中容易染上杂菌，获得单菌落的成功率低；(6)分离出电化学活性菌株后，采用回投至灭菌反应器的方法进行电化学活性的检验，操作繁琐且周期长。也有采用重新回投到MFC反应器中进行电化学活性鉴定，但操作周期长，且纯菌MFC启动较为困难，也容易染上杂菌而影响实验结果。
技术实现思路
本专利技术公开了一种厌氧产电菌的分离及电化学活性鉴定方法，解决了产电菌分离中滚管整套设备购置困难、培养基配制方法和厌氧滚管操作稀释倍数选择不合理、分离时严格厌氧条件较难达到、反复操作步骤和较长的筛选周期容易染上杂菌和纯菌的电化学活性的检验周期长等问题。 本专利技术所采用普通托盘和注射器代替滚管机和定量加样器，廉价易得且操作方便。本专利技术在培养基中加入维生素液、微量元素液和柠檬酸铁，且与培养基其他成分分开配制，其他成分采用高温高压法灭菌，此三种营养采用0.22μπι滤膜过滤除菌，可以有效避免V液、M液的营养作用在高温高压条件下失活和柠檬酸铁电子受体与碳源电子供体相互反应而被还原。本专利技术滚管操作时所选择的稀释倍数合理，获得微生物菌株数量多且菌落分散，分离纯化过程不易染杂菌，减少了滚管分离次数，提高了分离效率。专利技术中采用的直接在厌氧瓶中煮沸和注射器抽真空同时进行的方法除氧与传统的通氮气和煮沸除氧后再分装于厌氧培养瓶中的方法相比较，除氧效果更可靠和便捷，且对维持培养基体系的PH稳定效果明显。本专利技术产电菌的检验方法采用循环伏安法，操作简单，筛选周期短。 【专利附图】【附图说明】 图1为厌氧管中菌落附着图；图2为在Zl菌株的循环伏安曲线；图3为在Ζ2菌株的循环伏安曲线；图4为在Ζ3菌株的循环伏安曲线。 【具体实施方式】 1、在无菌无氧条件下，剪下微生物燃料电池大小为4mm2的正方形电极膜，投入含灭菌除氧的液体培养基的厌氧瓶中，置于培养箱中30°C条件下培养5天。 2、取步骤I中Iml菌液进行稀释倍数为1(Γ?07的倍比稀释，选择104、105、106和17四个稀释梯度的菌液注入有琼脂粉培养基的厌氧管中，平放在加有1/2托盘体积冷水的托盘(长X宽X高=27cmX17 cmX5cm)中快速滚动，待培养基在厌氧管内管壁冷凝形成均匀的薄层，再用封口膜密封厌氧管管盖的外侧，垂直放置于培养箱中35°C培养5天。 3、挑取步骤2中厌氧管中的单一菌落于无菌无氧培养基的厌氧瓶中扩大培养。 4、重复步骤2和步骤3共四次，直至厌氧管中形成形态大小一致的单菌落。 5、取生长旺盛的菌液10 mL,经离心和清洗操作4次后重悬于含10 mmol的磷酸盐缓冲溶液中，然后采用电化学工作站在高纯N2保护下，以Ag/AgCl为参比电极，玻碳电极为工作电极，在扫描速率50.0 mV/s,扫描范围_600mV飞OOmV之间循环测试菌悬液的氧化还原特性，绘制循环伏安曲线。 其中试验过程中培养基由基础培养基A和培养基B组合而成，培养基A的配比为:胰蛋白胨 4.0 8/1、牛肉浸膏4.0 8/1、酵母1.0 g/UCaCL2 0.2 g/1、NaCL 5.0 g/1、乙酸钠 16.0 g/1,FeSO4.7H20 0.2 g/1,MgCL2 0.2 g/1,K2HPO4 1.2 g/1、半胱氨酸 1.0 g/l、0.1%(w/v)的刃天青0.4 mL/L ;培养本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种厌氧产电菌的分离及电化学活性方法，其特征在于产电菌的分离按以下步骤进行：在无菌无氧条件下，剪下微生物电解池阳极膜，投入含灭菌除氧的液体培养基的厌氧瓶中，置于培养箱中培养；取上步骤中1ml菌液进行倍比稀释，选择合适的梯度稀释菌液注入有琼脂粉培养基的厌氧管中，平放在浸有冷水的滚管机中快速滚动，待培养基在厌氧管内管壁冷凝形成均匀的薄层，用封口膜密封厌氧管管盖的外侧，置于培养箱中培养；挑取上步骤中厌氧管中的单菌落于有培养基的厌氧瓶中扩大培养；重复哼盖特滚管和扩大培养，直至厌氧管中形成形态大小一致的单一菌落。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：朱葛夫，邹然，刘超翔，
申请(专利权)人：中国科学院城市环境研究所，
类型：发明
国别省市：福建;35