本发明专利技术公开了一种抗乙肝病毒人单克隆抗体的杂交瘤细胞系的构建方法，其先采用ＥＢＶ转化人Ｂ淋巴细胞，获得分泌抗－ＨＢｓ的转化Ｂ淋巴细胞系；然后用转化的Ｂ淋巴细胞与鼠浆细胞瘤细胞系ＦＯ的细胞进行细胞融合，构建分泌抗－ＨＢｓ ｈＭｃＡｂ的杂交瘤细胞系；该方法采用ＥＢ病毒转化技术和细胞杂交技术，构建分泌抗－ＨＢｓ五聚体ＩｇＭ ｈＭｃＡｂ的高产稳产杂交瘤细胞系，其易培养，融合率高，杂交细胞活力强，分泌抗体量大且稳定，同时还公开了乙肝导向干扰素及制备方法和应用，由抗－ＨＢｓ Ｆ（ａｂ′）↓［２］与ＩＦＮ交联形成的交联体分子量小，易于在体液中扩散达到染毒区，可大大提高“导向ＩＦＮ”杀灭病毒的作用，可在制备治疗慢性乙型肝炎、ＨＢ后肝癌等药物中的应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种抗乙肝病毒人单克隆抗体的杂交瘤细胞系的构建方法、乙肝导向干扰素及其制备方法和应用，属于生物工程
技术介绍
当前，生物工程抗体药的发展迅猛，据2004年12月生物工程学报报导，世界生物工程药销售额前10位中生物工程抗体药占40％。生物工程抗体药增长势头强劲，抗体类药物成为生物工程制药领域极为重要的成员，有望2005年成为最大的一类生物制品，预计2007年其销售额将突破200亿美元，占整个生物制药业的1/3，可见生物工程抗体药发展前景之远大。目前，用于治疗的生物工程抗体药主要是由基因工程研制的人源化抗体，人源化抗体虽然比鼠源单克隆抗体(mMcAb)异种蛋白成分要少得多，但仍含有5～10％的鼠源蛋白，用于治疗仍有引起人体不良反应的可能，当然用mMcAb治疗危险性就更大了。现基因工程研制人源化抗体或人源抗体有两个瓶颈，就是工程细胞对抗体的表达力度不够，抗体与抗体的靶子结合力太差，这是阻碍基因工程抗体发展的障碍，所以研制人源化单克隆抗体(McAb)广泛应用还难以实现。乙型肝炎(HB)在世界上，特别是东亚、东南亚、南亚及中东一带，均有严重流行，我国是HB大国，无症状带毒者1.3亿，显性HB患者3000万，无症状带毒者之中有些人迟早要发展为显性HB。HB发病时间长，有慢性化倾向，相当部分的HB患者转慢性肝炎、肝硬化，甚至转为肝癌，80～90％的肝癌为HB后肝癌，对人类的健康威胁极大，有的患者不仅丧失了劳动力还要巨大花费进行治疗，加上可能不良的预后反应，还影响到劳动就业，其精神压力也是不可忽视的。目前，市场出售种类繁多治疗HB的药物，但仍无治疗效果理想的药物，对HB的防治仍存在巨大的困难。奇怪的是，虽有HB工程疫苗的广泛应用，但HB的流行仍未见有明显的减少，便何况尚有20％的人群对HB疫苗的反应很差或无反应，可见对HB的防治在世界上仍是一个巨大的难题。如果有一种制剂能使HB的治愈率在普通IFN的基础上提高40％，传染率再降低40％，其社会效益和经济效益就是难以估量的。干扰素(IFN)是国内外学者公认的治疗乙型肝炎病毒(HBV)感染的较为有效的药物。但它的HB的治愈率仅为30％左右。干扰素是由于干扰素诱生剂诱导生物细胞产生的一类多功能、具抗病毒活性的糖蛋白。IFN的治疗机制就是它与染毒细胞接触后激发染毒细胞产生抗病毒蛋白，干扰病毒核酸对病毒蛋白的合成，从而杀灭病毒。同时IFN还可调节机体的免疫机能，提高抗病毒能力。但目前干扰素剂型存在有“敌我不分”的缺点，不论是有病还是无病的组织、器官和细胞都同等地接受药物作用，这样IFN的有效治疗量也接近了毒性量，干扰病毒复制的同时对人体正常细胞也有干扰作用，长期应用治疗量的IFN，对人体会产生不良作用，如脱发、白细胞减少及发烧等。那么能否有一种药物能够识别染毒区，从而在染毒区汇集较高的药物浓度，使药物充分发挥杀灭病毒的作用，药效增大，把毒性作用降到最小，不波及无辜，这便是“导向干扰素”的思路。目前研究人员正在积极探索只作用于病毒感染细胞而无损于正常细胞的导向治疗方法，导向治疗是应用现代医学生物技术把有效抗病毒药物作弹头，与一定靶向载体交联，特异性把治疗弹头运送到靶器官或靶细胞，以达到治疗目的，该法具有选择性较强，特异性较好，药物用量小，毒性低，能提高疗效等优点。其中疗效最佳是感染细胞水平的导向治疗方法，但该方法的设计还需要解决如下问题如何设计理想的药物载体，提高药物/载体分子化，如何提高载体的运转率及载体分子的稳定性、精确的靶向性，如何实现工业化大规模生产等。申请号为03134618.9，专利技术名称为分泌抗乙肝人单克隆抗体的异种杂交瘤细胞系的构建方法，采用异种杂交瘤细胞融合的工艺流程将抗-HBs阳性人脾淋巴细胞(SL)与鼠浆细胞瘤细胞系P3-X63/Ag8-653细胞融合，采用有限稀释法克隆抗体阳性孔杂交瘤细胞，得到稳产高产的分泌抗乙型肝炎病毒人单克隆抗体的异种杂交瘤工程细胞系。利用抗乙型肝炎病毒人单克隆抗体异种杂交瘤工程细胞系分泌的抗乙型肝炎病毒单克隆抗体，经分离纯化后与干扰素交联，可制成治疗乙型肝炎的“抗乙型肝炎病毒人单克隆抗体交联干扰素靶向制剂”和具有免疫作用的“乙肝被动免疫制剂”、“乙肝检测试剂”。申请号为03134617.0，专利技术名称为抗乙型肝炎病毒人单克隆抗体交联干扰素靶向制剂的制备方法，其抗乙型肝炎病毒人单克隆抗体以戊二醛作为交联剂与α-干扰素相交联，制备成“抗乙型肝炎病毒人单克隆抗体交联干扰素靶向制剂”。03134618.9和03134617.0专利申请中杂交细胞系的构建和交联体的制备所获得抗体阳性杂交瘤的机会少，抗体分泌量低，而且由于是抗体全分子与干扰素交联，因而交联体过大，不易在体液内扩散达到染毒区(主要是肝脏)，降低了抗病毒效果。因此目前不少研究人员致力于导向干扰素的研究开发，但重要的是构建的分泌抗-HBs hMcAb的杂交瘤细胞系是否稳定，能否大量工业化生产，同时所获得的抗乙肝病毒人单克隆抗体与干扰素的交联体要求活性高，分子量小，易于扩散至染毒区。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种抗乙肝病毒人单克隆抗体(抗-HBshMcAb)的杂交瘤细胞系的构建方法，该方法采用EB病毒转化技术和细胞杂交技术，构建分泌抗-HBs五聚体IgM hMcAb的高产稳产杂交瘤细胞系，其易培养，融合率高，杂交细胞活力强，分泌抗体量大且稳定。本专利技术的另一目的在于提供一种乙肝导向干扰素，由抗-HBs F(ab′)2与IFN交联形成的交联体分子量小，易于在体液中扩散达到染毒区，可大大提高“导向IFN”杀灭病毒的作用。本专利技术的再一目的在于提供一种乙肝导向干扰素的制备方法。本专利技术的再一目的在于提供一种乙肝导向干扰素在制备治疗慢性乙型肝炎、HB后肝癌等药物中的应用。为了实现本专利技术目的，本专利技术的抗乙肝病毒人单克隆抗体(抗-HBshMcAb)的杂交瘤细胞系的构建方法，包括如下步骤；先采用爱波斯坦-巴尔病毒(EBV)转化人B淋巴细胞，获得分泌抗乙肝表面抗体(抗-HBs)的转化B淋巴细胞系；然后用转化的B淋巴细胞与鼠浆细胞瘤细胞系FO的细胞进行细胞融合，构建分泌抗乙肝病毒人单克隆抗体(抗-HBs hMcAb)的杂交瘤细胞系。其中，EBV为爱波斯坦-巴尔病毒，一种疱疹病毒，引起传染性单核细胞增多症，对人的B淋巴细胞有良好的转化作用。具体地说，从抗HBs阳性健康人体收集外周血淋巴细胞(PBL)，与爱波斯坦-巴尔病毒(EBV)混合，并加入含1-2μg/ml头孢菌素A的完全培养基(含10％～20％胎牛血清的RPMI1640)中进行培养；40天后将转化B细胞以有限稀释法加以克隆，获得分泌抗-HBs hMcAb的转化B淋巴细胞系(命名为5-D9)。将EBV转化的B淋巴细胞系的细胞与鼠浆细胞瘤细胞系FO的细胞行细胞融合，细胞融合后，分加含有饲养细胞(BALB/C小鼠腹腔巨噬细胞、淋巴细胞或腹腔细胞等)的培养板进行培养，待杂交细胞在培养基中生长增殖到6～8×103个细胞/孔，对其培养上清以ELISA间接法检测抗-HBs的存在，对检测孔抗-HBs阳性的杂交瘤细胞以有限稀释法进行克隆，反复克隆8～10次，培养孔抗HBs阳性克隆可达100％，选出高产稳产的异种杂交瘤工程细胞系。将选出的本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种抗乙肝病毒人单克隆抗体的杂交瘤细胞系的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：先采用爱波斯坦－巴尔病毒转化人Ｂ淋巴细胞，获得分泌抗乙肝表面抗体的转化Ｂ淋巴细胞系；然后用转化的Ｂ淋巴细胞与鼠浆细胞瘤细胞系的细胞进行细胞融合，构建分泌抗乙肝病毒人单克隆抗体的杂交瘤细胞系。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张永忠，
申请(专利权)人：张永忠，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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