本发明专利技术涉及一种杂交瘤细胞株，ＣＣＴＣＣ保藏号为ＣＣＴＣＣ－Ｃ２００５０５，其能分泌抗ＨＢＶ表面抗原的单克隆抗体。用此种单克隆抗体包被建立的ＥＬＩＳＡ方法，不仅可以检测野生型ＨＢｓＡｇ，还可以检出除Ｔ１２３Ｍ／Ｃ１２４Ｒ和Ｔ１２３Ｎ以外的１５种变异中的１３种变异ＨＢｓＡｇ，检测变异株的能力明显优于国内同类产品。该单克隆抗体检测野生ＨＢｓＡｇ的最低浓度达到０．５ｎｇ／ｍＬ，符合国家制定的标准。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物制剂，具体地涉及一种分泌抗乙型肝炎病毒表面原抗(Hepatitis B surface antigen，HBsAg)的单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其所分泌的单克隆抗体。
技术介绍
HBsAg是诊断乙型肝炎病毒感染的重要标志。目前国内外HBsAg检测试剂盒多是利用抗-HBsAg单克隆抗体或多克隆抗体建立的ELISA检测方法。各种试剂盒使用的抗体不同，检测变异乙肝病毒的能力不同。目前的研究结果显示，国内的HBsAg检测试剂盒检测变异株的能力不佳，主要原因是没有可以很好的识别变异株的单克隆抗体。因此有必要研发出可以检测野生和变异HBsAg的单克隆抗体，建立检测方法，以显著降低HBsAg变异株的漏检率。HBsAg变异的原因非常复杂。目前认为乙肝疫苗免疫后抗HBV免疫球蛋白的形成，以及高效价免疫球蛋白预防，药物的压力以及病毒的持续感染与HBV突变有关。使用高效价免疫球蛋白也会导致HBV S基因突变，肝移植病人使用高效价免疫球蛋白后仍然有约30％的人感染HBV。自从上世纪80年代推广乙肝疫苗接种预防HBV感染以来，HBV感染的流行率显著降低，对人类的健康起到了很大作用。但是随着疫苗应用年限的延长，可逃避乙肝疫苗的S基因突变的免疫逃避株越来越多。目前报道，我国乙肝疫苗和HBIG母婴阻断失败者，S基因变异率约为20％-40％；我国单纯乙肝疫苗免疫后携带者变异率为31％。表面抗原变异株仍然具有致病性和传播能力，可能成为潜在的传染源，可能突破人群已有免疫力形成新的感染而成为新的公共卫生问题。因此，研究S基因突变株的预防和诊断，对控制HBV的感染，进行HBV感染流行的监测以及献血员的筛查有重要意义。HBV S基因突变株的预防和诊断对献血员的筛查也有重要意义。目前我国对献血员的筛查主要是通过血清学的方法。乙肝变异株的出现给血液制品的筛查提出了问题。变异株与野生株HBsAg的抗原性有很大改变；表面抗原“a”决定簇145等位点氨基酸变异后，抗原性会发尘较大改变，约60％变异表面抗原与针对野生型HBsAg的单克隆抗体的抗原反应性减弱或消失，用国内外现行表面抗原诊断试剂盒不能检测出，漏检率从12％-90％不等。变异株感染的病人容易漏检，变异株污染的血液制品也不易发现，对HBV的预防控制带来困难。目前用于检测HBV突变的方法主要有直接测序、有限稀释PCR、克隆筛选和特异基因序列固相聚合酶链反应(SS-SPPCR)。特异基因序列固相聚合酶链反应(SS-SPPCR)是检测HBV基因点突变的和区分野毒株与变异株的混合感染灵敏而特异的新方法。这些方法检测基因突变的特异性很好，但费用昂贵，需要许多大型仪器设备和熟练的技术人员，操作复杂，检测时间长，不易在我国推广使用。检测HBsAg的常用方法是ELISA，决定方法灵敏性和特异性的关键是有合适的抗-HBsAg的单克隆抗体。目前有许多研究单位制备了可以应用于临床检测的相关单克隆抗体，但主要是用于检测野生株，可以较好识别变异株的单克隆抗体迄今尚未见报道。因此，筛选可以识别变异株的单克隆抗体具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决上述
技术介绍
存在的不足，提出制备一种抗-HBsAg的杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体，使其制备的试剂能在检测出乙肝病毒野生株的同时还能检测出多种乙型肝炎病毒变异株。本专利技术所述杂交瘤细胞株是通过免疫、融合以及筛选得到的，属于鼠源杂交瘤细胞D12E9F11，其CCTCC保藏号为200505，它能分泌抗HBsAg的单克隆抗体。该杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体能同时与野生型和突变型HBsAg进行特异性的结合反应。本专利技术所述杂交瘤细胞的特征细胞系名称(Cell line Name)鼠源杂交瘤细胞D12E9F11种名(Species)Mouse衍生组织(Tissue Derived)小鼠骨髓瘤细胞SP2/0形态学(Morphology)Lymphoblast传代培养液(Medium and Supplement)RPMI1640 90％；FCS10％生长条件(Growth Condition)37℃，CO25％冻存基质(Freeze Medium)FCS 90％，DMSO 10％ 分泌物(抗体)特征抗体类别1gGl抗体效价上清≥1×103ELISA腹水≥1×107ELISA抗体亲和力用于野生型HBsAg检测灵敏度可以达到0.5ng/ml，超过我国食品与卫生监督局颁布的标准(标准为1.0ng/ml)，检测常见变异Gly145Arg HBsAg的灵敏度可以达到1.0ng/ml。存活性(Viability)≥90％本专利技术用途直接用途建立可以同时检测乙肝病毒突变株和野生株在内的乙肝病毒表面抗原的临床检测实验技术。包括ELISA，胶体金免疫渗析，多种乙肝病毒抗原的固相与液相分析，以及多种免疫病理检测技术等。这些方法的建立，能在很大程度上突破常规乙肝病毒表面抗原检测试剂在多种变异株检测上的限制。间接用途采用本细胞株分泌抗体所开发的实验技术与试剂，可广泛地用于乙肝的基础、临床与流行病学研究，尤其是用于对献血人员中乙肝病毒变异株感染者的筛选。本专利技术对推动我国病毒性肝炎的防治与研究，对进一步推进乙肝的临床、流行病学发展以及预防输血性肝炎的传播具有及其重要的价值。具体实施例方式一、抗-HBsAg的单克隆抗体细胞株的建立1、免疫原的制备免疫原为从HBV感染者血清中分离的HBsAg。2、免疫动物取HBsAg 20ug稀释在100ul生理盐水中，加入等量的氢氧化铝佐剂，混匀后，在BALB/c小鼠(6周龄)颈背部皮下多点注射。间隔2和4周后，取同量抗原加不完全佐剂追加免疫两次，免疫结束后采集少许鼠血，检测HBsAb效价。融合前2天，用相同剂量抗原腹腔注射追加免疫。3、免疫效价检测使用上海科华生物公司HBsAg预包被96孔聚苯乙烯板检测免疫后小鼠血清效价检测。鼠血清用含10％牛血清PBS以102-106倍稀释，加入96孔板，0.1ml/孔，37℃，60分钟。甩去孔中液体，扣干，用洗涤液注满各孔，静置15秒，甩去孔中液体，拍干。重复5次。每孔加l∶4000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG 50ul于各孔中，37℃，45分钟。重复上洗涤。加50ul含有0.1％(W/V)邻苯二胺0.1％，50ul双氧水PH5.0柠檬酸磷酸缓冲液，振荡混匀，置37℃，15分钟。用1M硫酸终止显色后，振荡混匀，在492nm波长读数。以测定值与对照值的比≥2.1为阳性来判断免疫鼠血清的校价。3、细胞融合建株术次加强免疫后，无菌取小鼠脾脏，收集脾细胞，用无血清培养液洗3次，计数并测定细胞活力。收获对数生长期的骨髓瘤细胞，作活细胞计数，细胞活力应不低于95％。将1×108脾细胞与2×107骨髓瘤细胞在50ml尖底离心管中混匀，离心，弃去上清液，加入0.7ml分子量为4000的PEG作为融合剂，使其融合，用HAT选择培养基培养，使杂交瘤细胞能生长，待细胞长至105/ml时，同上免疫效价测定法筛选检测细胞分泌抗体情况；4、有限稀释法对阳性克隆的克隆化培养用弯吸管吹打杂交瘤细胞培养板中孔内的克隆，悬浮于完全培养液中。计数细胞，调整细胞浓度至100个/ml、50个/ml、10个/ml。分别将三种密度的杂交瘤细胞悬液接种于含本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种杂交瘤细胞株，ＣＣＴＣＣ保藏号为ＣＣＴＣＣ－Ｃ２００５０５，其能分泌抗ＨＢＶ表面抗原的单克隆抗体。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：杨东亮，李方和，田拥军，张振华，龚劲松，
申请(专利权)人：华中科技大学同济医学院附属同济医院，
类型：发明
国别省市：83[中国|武汉]
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