一种水稻杂种育性基因及其应用制造技术

本发明专利技术涉及植物基因工程技术领域，具体涉及水稻杂种育性基因Ｓｂ的分离克隆和应用。本发明专利技术包括水稻杂种育性基因的ＤＮＡ序列、其编码的蛋白质、含有所述ＤＮＡ序列的载体、所述载体转化的宿主细胞。本发明专利技术还涉及利用所述基因培育水稻杂种育性亲和系的方法和应用，以及鉴定水稻杂种育性基因型的分子标记及其应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程领域，具体涉及一种水稻杂种育性基因的分离克隆及其在水稻杂交育种中的应用。
技术介绍
植物通过不同品种间的杂交产生杂种。杂种在生长势、适应性、产量等方面具有优势，称为杂种优势。利用杂种优势可以提高农作物的产量、品质和抗性。栽培稻(Oryza sativa L.)的籼稻(indica)和粳稻(japonica)亚种间杂种有强大的杂种优势，增产潜力很大。另一方面，通过栽培稻与野生稻杂交和回交等育种方法，可以将存在于野生稻的一些有用性状如抗病、抗虫、高产等导入栽培稻，培育出优良新品种。但是，籼粳亚种间杂交以及栽培稻与野生稻杂交产生的杂种存在育性低或不育的问题，称为杂种不育(hybrid sterility)。所述的杂种不育是稻属物种分化过程中产生的生殖隔离的机制之一，属于合子后生殖隔离(postzygotic isolation)。杂种不育现象严重阻碍了水稻杂种优势和野生稻有用基因的利用。已发现20个以上的基因座与水稻杂种育性有关；这些杂种育性基因座中，有些是导致雌配子不育，如S5，S7，S8，S9，S15，S17，有些是导致雄配子(花粉)不育，如Sa，Sb，Sc，Sd，Se，Sf(Kinoshita 1995，RiceGenet.Newsl.，129-15；Ikehashi等1988，Japan J.Breed.38283-291；Ikehashi等1996，Rice Genet III，pp404-408；Wan等1996，Theor ApplGenet 92183-190；Wang等1998，Rice Genet Newsl 15151-154；张桂权等1989，中国水稻科学397-101；张桂权等1993，遗传学报20222-228；张桂权等1993，遗传学报20541-551；张桂权等1994，遗传学报2134-41)。这些基因在不同品种或品系或野生稻材料中可以有不同程度的变异分化，产生多种复等位基因。根据携带这些复等位基因的水稻亚种类型以及对杂种育性的效应，它们被划分为籼型(Si)、粳型(Sj)、亲和型(Sn)、或其它过渡类型。所述的基因符号S代表杂种不育性(Sterility)，S5，Sa，Sb等指特定的杂种育性基因座，i，j，n分别代表籼型(indica)、粳型(japonica)、和中性型(neutral)的复等位基因，如Sbi、Sbj、或Sbn。中性型也称为亲和型(compatibility)或广亲和型(wide compatibility)。在水稻杂种中，分化程度较大的杂种育性基因在杂合状态下往往发生不亲和互作，导致携带某一等位基因的雄配子(或雌配子)发育不正常。这种现象也称为杂种的等位基因选择性杀配子效应。但是，这些基因在纯合状态下(如纯合的亲本)不影响配子的正常发育。大部分杂种不育基因座的遗传行为符合“单座位孢子体-配子体互作”的模式(Ikehashi等1986，IRRI(ed)Rice Geneticspp119-130)。例如，用分别携带SbjSbj和SbiSbi基因型的水稻粳稻和近等基因系杂交，产生的杂种一代(F1)的基因型为SbiSbj。其产生的雄配子中，携带Sbi等位基因的正常可育，而携带Sbj等位基因的大部分雄配子发育异常(不育)，导致F2代群体中携带SbjSbj基因型的植株的比例严重偏少，即严重偏离SbiSbi∶SbiSbj∶SbjSbj＝1∶2∶1的分离规律。但是，用携带亲和型等位基因SbnSbn的亲本与携带SbiSbi或SbjSbj等位基因的水稻亲本杂交(F1的基因型为SbnSbi或SbnSbj)，F2代群体中3种基因型的分离符合1∶2∶1的分离规律，即该杂合的等位基因不产生选择性杀配子效应，Sbn对籼型和粳型等位基因都是亲和的。不同座位的杂合SiSj基因可分别产生选择性杀配子效应，因此在杂种中存在多个座位的杂合SiSj基因时可产生累加的效应，使杂种不育更为严重。反之，如果使杂交亲本在尽可能多的S基因座位携带亲和型等位基因或相同等位基因，就可以提高水稻杂种的育性。例如，目前的水稻杂交育种中通常使用广亲和系(品种)为亲本与籼稻或粳稻杂交，其杂种的育性有一定程度的提高。所述的广亲和品系(种)是指在多个杂种不育基因座携带亲和型等位基因的品系(种)。但是，可利用的广亲和品系(种)较少，多数属于非籼非粳的中间类型，杂种优势不够强，其农艺性状也不能满足现代水稻育种的多种多样的要求。目前已报道了一些水稻杂种育性基因的染色体定位，但在本专利技术申请提出之前尚未有水稻杂种育性基因被分离克隆的报道，杂种不育或亲和(可育)的分子基础还不清楚。Sb，或被命名为f5，是影响水稻杂种花粉育性的基因之一，它已被定位于第5染色体(庄楚雄等2002，遗传学报29700-705；李文涛等2002，植物学报44463-467；李文涛等2006，科学通报51404-408；Wang等2006，Theor.Appl.Genet.112382-387)。为了在杂交水稻育种中有效地克服杂种不育性问题，本专利技术通过图位克隆(map-based cloning)技术获得了水稻杂种育性基因Sb的多个等位基因，包括亲和型等位基因，通过转基因实验验证了此基因的功能，并提出通过基因工程技术或杂交-回交育种培育杂种育性亲和系的方法。
技术实现思路
(一)专利技术目的本专利技术的目的是分离克隆水稻杂种育性基因和包含调控这个基因的启动子的DNA片段。本专利技术的第二个目的是提供上述杂种育性基因所编码的蛋白质。本专利技术的第三个目的是提供上述杂种育性基因在培育杂种育性亲和系中的应用。本专利技术的再一个目的是提供上述杂种育性基因产生的分子标记或其紧密连锁标记及其在水稻杂交育种中的应用。(二)技术方案本专利技术涉及分离和应用一种包含杂种育性基因Sb的DNA片段，该片段赋予水稻品种(系)间或水稻与野生稻间杂交产生的杂种的雄配子具有正常的育性。本专利技术利用图位克隆法克隆了Sb基因，其技术步骤如下1、多态性分子标记的筛选及Sb基因的连锁定位目前已把Sb定位于水稻第5染色体上的大致区域(庄楚雄等2002，遗传学报29700-705)。根据公开的水稻基因组序列数据库的资料(http//www.ncbi.nlm.nih.gov)，在该区域发展了多个分子标记。经过连锁分析，发现6个与Sb紧密连锁或共分离的多态性标记，并把Sb精细定位在一个5kb的区间。2、DNA序列分析根据公开的水稻基因组序列数据库的资料(http//www.ncbi.nlm.nih.gov)，在定位的5kb区间内只有1个预测的基因。3、Sb基因的功能验证用PCR方法从1个亲和品系WS59扩增亲和型等位基因Sbn，它包括启动子区、编码区、以及下游序列，构建植物转化表达载体。用土壤根癌农杆菌介导法转化粳稻T65，再与近等基因系E2杂交，产生杂种F1，其基因型为SbiSbj/Sbn-，其中SbiSbj为杂种的内源Sb基因型，Sbn为导入的转基因。导入Sbn的杂种植株的可育花粉率提高，其自交后代F2中，含有SbjSbj基因型的植株的比例大大提高，表明大部分Sbj型雄配子的育性恢复正常。这些结果证明了Sbn等位基因具有克服杂种不育的生物学功能。4、Sb复等位基因的序列测定比较分析用PCR技本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种水稻杂种育性基因，其编码蛋白的序列为：ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２或ＳＥＱＩＤＮＯ：４或ＳＥＱＩＤＮＯ：６；或ｂ）它们中替换、缺失、或添加一个或几个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘耀光，杨绍华，陈竹锋，庄楚雄，梅曼彤，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]