本发明专利技术涉及一种表达野生型或突变型禽流感病毒Ｈ５亚型血凝素（ＨＡ）蛋白的重组新城疫ＬａＳｏｔａ弱毒疫苗株，更具体地，重组新城疫ＬａＳｏｔａ弱毒疫苗株是ｒＬａｓｏｔａ－Ｈ５ｗｔＨＡ和ｒＬａｓｏｔａ－Ｈ５ｍｕｔＨＡ。本发明专利技术还公开了制备所述重组新城疫ＬａＳｏｔａ弱毒疫苗株的方法和该重组新城疫ＬａＳｏｔａ弱毒疫苗株在制备预防禽流感的疫苗中的应用。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及重组病毒疫苗领域，更具体地，本专利技术涉及一种表达编码野生型或突 变型禽流感病毒H5亚型血凝素(HA)蛋白的基因的重组新城疫LaSota弱毒疫苗株，更具体 地，重组新城疫LaSota弱毒疫苗株是rLasota_H5wtHA和rLasota-H5mutHA。本专利技术还公开 了制备所述重组新城疫LaSota弱毒疫苗株的方法和该重组新城疫LaSota弱毒疫苗株在制 备预防禽流感的疫苗中的应用。
技术介绍
新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)为不分节段单股负链RNA病毒，作 为副粘病毒科的重要成员和模型病毒，得到深入研究。重组NDV作为活病毒疫苗载体具有 非凡的优点包括LaSota株在内的NDV弱毒疫苗长期以来一直用于家禽防疫，其安全有 效性已被充分证明；NDV遗传相对稳定，仅有一个血清型，毒株间发生重组及毒力返强可能 性极小；复制过程在细胞浆内完成，从RNA到RNA，不存在DNA阶段及细胞基因组整合的可 能；NDV弱毒疫苗可同时诱导全身性体液免疫、局部粘膜免疫及细胞免疫的形成，形成更加 全面、确实的免疫保护；可通过饮水、喷雾、滴鼻、点眼或注射多种方式给苗，使用极为方便； NDV具有高滴度的鸡胚生长特性，生产成本极为低廉d’7’8’11’12’13)。NDV为高度传染性和高度 致死性的家禽疫病原，我国每年用于新城疫防制的弱毒疫苗至少在百亿羽份以上。NDV作为 活病毒疫苗载体应用的经济意义十分巨大。负链RNA病毒的反向遗传操作(Reverse genetic)是通过操作病毒基因组cDNA 制造新病毒的过程，其基本过程是①组装完整的病毒基因组(或重组型基因组)cDNA克 隆，5’末端精确地缀于T7启动子后，3’末端精确缀于自我剪切的核酸酶序列和T7转录终 止信号之前，构成基因组cDNA转录模板；②以基因组cDNA转录模板与启动病毒复制必须的 转录相关功能结构蛋白如核蛋白(NP)、磷酸蛋白(P)和聚合酶蛋白(L)的表达质粒(T7启 动子)一起，共转染整合表达T7聚合酶的病毒复制许可细胞；③M-72小时后收获培养上 清，过滤后继续敏感细胞传代或接种鸡胚尿囊腔救获(rescue)病毒。对基因组cDNA进行 突变、缺失或外源基因插入修饰后，通过反向遗传操作系统(reverse genetic system,RGS 系统)可获得相应的突变或重组的负链RNA病毒(1’2’3’4’5’6)。NDV基因组全长15186核苷酸，与其它副粘病毒一样，包括核蛋白(NP)，磷蛋白 (P)，基质蛋白(M)，融合蛋白(F)，凝集素神经氨酸酶蛋白(HN)，和大聚合酶蛋白(L)六个 独立转录编码单元(图1A)。NDV和其它负链RNA病毒一样，其最小感染单位是核糖核蛋 白复合物，无蛋白包裹的RNA本身并无感染性。NDV的基因组RNA通过与NP、P、L蛋白一起 组成核蛋白复合体，启动RNA的首轮转录及病毒蛋白的翻译合成、产生感染性子代病毒(7’ 1(°。根据这一原理，1999年欧洲学者率先建立了第一个高致病性NDV的反向遗传操作系统 (reverse genetic system, RGS 系统)⑵。禽流感是危害世界养禽业发展的重要疾病，高致病力禽流感可导致感染禽群 100%的死亡，被国际兽疫局列为A类烈性传染病。H5亚型历史上引起高致病力禽流感暴 发。2003年末至2004年初以来，韩国、日本、越南、泰国、印尼、柬埔寨、老挝以及中国大陆等 亚洲国家相继暴发H5亚型高致病力禽流感，现有禽流感灭活疫苗和禽痘活载体疫苗具安 全、免疫保护效果好的优点，但仍存在着制造成本高、使用相对不便的不足。研制高效安全、 成本低廉、使用方便的新一代疫苗具有重要的现实意义。(Avian Influenza, Al)(Avian Influenza Virus, AIV) 引起的禽类感染和/或疾病综合征，AIV在分类学上属于病毒界(Vira)—一正粘病毒科(Orthomyxoviridae)----流感病毒属(Influenza Virus A and B)----禽流感病毒(Avianlnfluenza Virus)。禽流感病毒属于正粘病毒科流感病毒属的A型流感病毒，基因 组由8个单股负链RNA片段组成。其表面结构蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)抗原性 不同，被划分为不同亚型。血凝素(HA)是禽流感病毒主要的免疫原蛋白，它可诱导机体产 生抗体介导的特异性体液免疫及细胞免疫应答，抗HA的抗体可以通过干扰病毒与唾液酸 受体的结合或者病毒囊膜与内吞体膜的融合过程从而中和病毒的感染。AIV的致病力与其 表面结构蛋白HA裂解位点的氨基酸序列密切相关。低致病力AIV的HA裂解位点只有一个 碱性氨基酸精氨酸(R)，这一结构决定了这些病毒感染动物后只能在呼吸系统内繁殖，因为 只有呼吸道上皮细胞内含有一种精氨酸特异的类似胰酶的蛋白酶，可将裂解位点含单一碱 性氨基酸精氨酸的HAO裂解为有活性的HAl和HA2，启动病毒的吸附和复制周期。高致病力 H5和H7亚型AIV HA裂解位点含有连续的多个碱性氨基酸残基-RKKR-，可被体内多种细胞 内广泛存在的蛋白酶识别和裂解，因此具有广泛的组织嗜性，一旦感染便会造成全身性扩 散并导致迅速死亡。与可感染人的H1、H2、H3及H9等亚型流感病毒相比，高致病性的H5 和H7亚型AIV对人类的潜在危害更为巨大，因为一旦感染人后即可能全身性扩散和迅速致 死。2001-2002年，Palese. P.等相继构建表达Hl亚型流感病毒HA免疫原基因的重组 NDV Bl株和表达H7亚型流感病毒HA免疫原基因的重组NDVBl株，免疫试验表明这两种NDV 活载体疫苗可分别在小鼠和禽类诱导保护性免疫反应。但是由于Bl本身高度致弱，在免疫 接种鸡体内的复制能力较差，因而诱导免疫鸡形成有效免疫保护的能力也相对较弱，试验 表明，表达H7亚型HA基因的NDV Bl株对NDV及H7亚型高致病力禽流感致死性攻击的存 活保护分别仅为60%和40%，且不能阻止病毒在体内的复制和排放(12)。研究表明，NDV基 因组在不同位点插入外源报告基因或免疫原基因，经细胞或鸡胚连续高代次传代仍保持高 度的遗传和表达稳定性("’12’13)。但由于上述表达系统、活病毒载体本身的不足与缺陷以及 使用成本等原因，均未实现在生产实际的广泛应用。
技术实现思路
针对上述研究背景，本专利技术人为进一步提高禽流感病毒表达抗原的免疫原性， 构建表达野生型和突变型禽流感病毒HA免疫原蛋白的重组NDV活载体二联弱毒疫苗 rLasota-H5wtHA和rLasota-H5mutHA，通过滴鼻、点眼、肌肉注射甚至饮水、喷雾吸入等多 种途径免疫动物以诱导对禽流感的保护免疫反应，用于禽类新城疫与禽流感的预防免疫。因此，本专利技术的一个目的是提供一种表达编码野生型或突变型禽流感病毒H5亚型血凝素(HA)蛋白的基因的重组新城疫LaSota弱毒疫苗株。在一个实施方案中，所述编码野生型HA蛋白的基因具有SEQ ID No 1所示的核苷 酸序列。在另一个实施方案中，所述编码突变型HA蛋白的基因具有SEQ ID No 2所示的核 苷酸序列。优选所述新城疫LaSota弱毒疫苗株是AV1615，更本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：步志高，陈化兰，
申请(专利权)人：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，
类型：发明
国别省市：93
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