培养哺乳动物味细胞的方法技术

本发明专利技术提供了培养哺乳动物味细胞的方法，味细胞包括味觉感受器细胞。将细胞维持长达三个月和更长的时间，同时维持成熟味细胞的分子和功能特征。将细胞在有涂层的培养容器上培养，从第一次更换培养基开始，以至少５天的间隔更换培养基。本发明专利技术进一步提供了味细胞的分离和培养方法，其中将使细胞暴露于分离溶液和蛋白水解酶的时间最小化并将细胞在有涂层的培养容器中培养，从第一次更换开始以至少５天的间隔更换培养基。本发明专利技术进一步提供了培养的味细胞、转染和测定方法，以及具有约３００－３２０的摩尔渗透压浓度和约７．０－７．３ｐＨ的味细胞测定缓冲液。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及哺乳动物味细胞的分离和长期细胞培养的方法。哺乳动物味细胞包括应答味觉刺激物或呈味物质(tastant)的哺乳动物味觉感受器表达细胞。本专利技术的方法使得对味觉感受器细胞的研究持续延长的一段时间，例如长达三个月或更长时间。此外，本专利技术的方法与已知方法相比较降低了需要从其分离味细胞的动物数量。由于本专利技术的方法允许味细胞在体外增殖和分化，使得包括增殖和分化的味细胞过程的体外研究，例如这些过程所需要的营养因子的测定成为可能。将味细胞培养一段延长的时间的能力使得能够进行需要较长时间范围的实验。背景味蕾由大约50-100个味细胞组成，味细胞包括呈现神经元和表皮特性的三种形态类型。基于免疫细胞化学特征，可以将这些味细胞分类为I型(暗)、II型(亮)和III型(居中)(Yee等，J Comp Neurol.2001年11月5日；440(1)97-108；Takeda等，J Comp Neurol.2004年11月1日；479(1)94-102)。研究表明这些味细胞中的大约10％呈现出对神经细胞粘附分子(NCAM)的免疫反应性。虽然NCAM-免疫反应性细胞是III型细胞，但不是所有的III型味细胞对NCAM是免疫反应性的(Nelson和Finger1993，J Comp Neurol 336(4)507-16)，且味细胞中的NCAM表达依赖于IX神经的神经支配(Smith等，1994，J Comp Neurol 347(2)187-96)。这些和其他数据表明了NCAM表达味细胞与神经相联系。相反，对味觉刺激物的功能性应答所需要的关键分子不在NCAM免疫反应性细胞中表达。例如，味转导素，是一种参与味觉传导的关键性G-蛋白并且只存在于II型细胞中。然而，没有在NCAM表达细胞中检测到味转导素(Takeda等，1992，J.Electron Microsc.41(5)375-80；Yang等，2000，J.Comp Neurol 425(1)139-51)。认为味细胞源自上皮细胞谱系，具有10天的有限平均寿命，其中垂死细胞由基细胞群替代。报道了大部分的味细胞的原代细胞培养物最多持续数天，例如，最多3至5天(比较，例如，对于小鼠味细胞，改良自哺乳动物中枢神经元分离的方法，Spielman等，1989，BrainResearch 503326-29；而对于大鼠味细胞，Kishi等，2001，Neuroscience 106(1)217-25，和Stone等，2002，Chem.Senses27779-87)。为了能够检测给定的呈味物质，味细胞通常需要呈味物质(例如，苦味、甜味、鲜味(umami))的相关味觉感受器和味觉传导所必需的分子二者。味觉感受器可以包括一种或多种T2R和/或一种或多种T1R。信号传导分子可以包括味转导素和磷脂酶C。在此将表达至少一种味觉感受器并能够应答至少一种味觉刺激物/呈味物质的细胞称为“味觉感受器细胞”。因此，味细胞在其他细胞类型中包括味觉感受器细胞。迄今为止，不存在味觉感受器细胞的细胞培养物模型，且任何体外研究都必须依赖于维持有限时间的味细胞的原代细胞培养物。Ookura等(2002，In Vitro Cell.Dev.Biol.-Animal 38365-72)描述了从小鼠味觉上皮分离的特定类型的细胞，这些细胞已经基于它们的整联蛋白β1标记得到了分选并表达NCAM标记。因此，这种整联蛋白阳性连续小鼠细胞培养没有产生与那些负责味觉刺激物初级检测的细胞相似的细胞。Ruiz等(2001，Chem.Senses 26(7)861-73)报道了源自味蕾的原代细胞培养物维持了长达14天，条件是将细胞保持于室温，认为这减缓了各种细胞过程。值得注意的是，保持于37℃的细胞只能维持几天，和之前所报道的相同。报道了保持于室温的细胞在第10天左右开始死亡，这与预期的味细胞的平均寿命相符。Ruiz等1995年公开的实验方案(“Tissue Culture of Rat Taste Buds”(大鼠味蕾的组织培养)，编辑Spielman AI，Brand JG Experimental Cell Biologyof Taste and Olfaction(味觉和嗅觉的实验细胞生物学)，CRC出版社，1995)公开了相似的室温下方法，该方法提及了长达18天的培养持续时间。概述本专利技术总地涉及分离、培养和/或测定哺乳动物味细胞的方法，味细胞包括味觉感受器细胞，以及涉及培养的哺乳动物味细胞。本专利技术内包括，该方法步骤为在合适的细胞培养基中和有涂层的细胞培养容器上(其中在培养容器情况下的术语“上”包括其中)培养味细胞，并从第一次更换培养基开始，以至少约5天的间隔更换培养基。一些实施方案中，味细胞包括味觉感受器细胞。一些实施方案中，味细胞只包括味觉感受器细胞。优选的实施方案中，细胞培养基包括含有15-20％ MCDB 153、10％ FBS、10ng/ml胰岛素和抗生素的Iscove氏培养基。培养容器的涂盖物优选包括胶原。本专利技术还包括通过分离舌上皮来分离和，其中将舌上皮中的味细胞暴露于存在或不存在蛋白水解酶的分离溶液的时间长度最小化，在合适的细胞培养基中和在有涂层的细胞培养容器上孵育分离的味细胞上皮碎片，并且，从第一次更换培养基开始，以至少5天的间隔更换培养基。味细胞暴露于含有或不含蛋白水解酶的分离溶液的时间长度为约30分钟或更短时间。在一些实施方案中，味细胞包括味觉感受器细胞，一些实施方案中，味细胞只包括味觉感受器细胞。优选的实施方案中，细胞培养基包括含有MCDB 153、FBS、胰岛素和抗生素的Iscove氏培养基。更优选的实施方案中，细胞培养基包括含有15-20％ MCDB 153、10％ FBS、10ng/ml胰岛素和抗生素的Iscove氏培养基。培养容器的涂盖物优选包括胶原。本专利技术进一步包括根据本专利技术的方法培养或分离并培养的味细胞。优选的实施方案中，味细胞是味觉感受器细胞。味觉感受器细胞优选应答至少一种味觉刺激物。可以将本专利技术的培养的味细胞在约37℃培养至少约10天，在约18-37℃培养至少约20天。本专利技术还包括味细胞的培养物。一些优选的实施方案中，本专利技术提供在细胞培养物中分裂超过48小时，优选超过约5天，更优选超过约2周的哺乳动物味觉感受器细胞。本专利技术还提供了具有约300-320毫渗摩的摩尔渗透压浓度和约7.0至约7.3的pH的味细胞测定缓冲液，以及将味细胞维持于这样的缓冲液中的方法。进一步关注转染的培养的哺乳动物味细胞。本专利技术的转染细胞可以用载体DNA，如质粒或病毒载体DNA转染。还提供了转染培养的味细胞的方法，该方法通过使培养的哺乳动物味细胞接触核酸，诸如但不限于，载体DNA，例如，病毒载体DNA或质粒载体DNA来进行。本专利技术还包括使用培养的哺乳动物味细胞的测定方法。一些优选的实施方案中，测定方法中所用的味细胞测定缓冲液具有300-320毫渗摩的摩尔渗透压浓度和7.0至7.3的pH。提供了测定对候选味觉刺激物的味觉应答的方法，该方法包括将培养的味细胞暴露于候选味觉刺激物，并将该味细胞对候选味觉刺激物的一种或多种细胞应答与培养的味细胞对标准味觉刺激物的应答相比较，其中培养的味细胞对候选味觉刺激物本文档来自技高网...

【技术保护点】
培养哺乳动物味细胞的方法，包括：ａ．在合适的培养基中和有涂层的细胞培养容器上培养味细胞，和ｂ．从第一次更换培养基开始，以至少约５天的间隔更换培养基。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：NE罗森，MH厄兹代内尔，
申请(专利权)人：蒙奈尔化学感觉中心，
类型：发明
国别省市：US[美国]