病毒载体制造技术

本发明专利技术提供编码有复制能力的病毒的质粒，其用于治疗的用途，更具体地用于治疗细胞增殖性疾病、免疫学疾病、神经紊乱、获得性感染和炎症的用途，以及包含这种质粒与转染剂的配制物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本申请要求在2004年11月24日提交的美国申请60/630,963的优先权，其公开内容通过参考并入本文中。本专利技术涉及运送在体内有复制能力的病毒用于治疗目的的领域，尤其是可将所述病毒引入患者或宿主内的新方法。病毒是目前在非人动物和人中广泛使用的对抗疾病的治疗剂。具体而言，利用病毒作为载体用于基因治疗。作为替代，已将细胞裂解型病毒用于靶向和杀死癌或不希望的增殖细胞，这样的治疗也称为“病毒疗法”。因此，在医学处理中直接使用病毒是一个广泛增长的领域，并且正在开发在处理和治疗中涉及病毒的新技术和用途。病毒是高效进入其宿主细胞并利用该细胞的细胞机器辅助其复制的高度进化的生物学实体。正因如此，它们被预言为理想的基因治疗载体，因为外源/异源基因或编码序列可插入病毒基因组中并进行感染，由此使得外源基因可以被运送至宿主细胞的核中。基因治疗首先被设想用于治疗其中缺陷是遗传性单基因缺陷的遗传疾病，例如重症联合免疫缺陷病(SCID)。不过，目前的基因治疗范围要广泛的多，设想可利用病毒运送针对获得性疾病的基因，所述获得性疾病诸如癌症、心血管疾病、神经退行性病变、炎症甚至传染性疾病。目前有5类主要的临床可利用病毒载体，它们来源于致癌逆转录病毒(oncoretroviruses)、慢病毒、腺病毒、腺伴随病毒(AAV)和1型单纯疱疹病毒(HSV-1)。每类载体的特征在于使之适用于特定应用且不适用于其它应用的一组不同性质。这五种主要类型的病毒载体可依照它们的基因组是整合入宿主DNA中(致癌逆转录病毒和慢病毒)还是主要作为染色体外附加体持续存在于细胞核内(AAVs、腺病毒和疱疹病毒)而分成两组。此区别是各载体对于特定应用的适用性的重要决定因素；非整合性载体，在某些情况下，可在非增殖细胞内介导持续的转基因表达，但是如果需要在分裂细胞中维持稳定的遗传改变，那么当前整合型载体是值得选用的工具。致癌逆转录病毒载体是开发的第一类病毒载体，迄今为止已广泛用于临床试验中。它们传统上是干细胞离体转导选用的载体。不过，大多数工作集中于慢病毒载体的研发，它们可自然侵入完整的核膜并转导非分裂细胞。慢病毒载体可能是未来许多疾病治疗中的重要载体系统。它们已被证实是递送基因至中枢神经系统的有效工具，其在没有炎症的情况下产生长期的基因表达。至于“病毒疗法”技术，其中的病毒利用其裂解细胞的能力破坏正在增殖的细胞，诸如癌细胞，病毒不必携带任何外源编码序列或运送任何序列至靶细胞。在这样的策略中使用只靶向于正分裂细胞的病毒可以是非常理想的，使得只有正在增殖的细胞被破坏。在这样的情况下还可在病毒载体中插入核酸序列使得可以通过在系统中添加药物破坏病毒，从而可以更高程度的调控。裂解病毒包括腺病毒。载体向性(即，宿主细胞靶向)、靶细胞内转基因表达的持续时间和载体的免疫原性是影响具体治疗应用中载体选择的另外因素。可论证地，腺病毒载体在递送其核酸序列至细胞核方面是最有效率的载体类型，并且直接注射腺病毒载体可高效地转导大部分组织。重组AAV载体(rAAV)是用于在非增殖组织中长期安全的基因转移和表达的最有前景的载体系统之一。AAV在正开发用于基因治疗的病毒中是独特的，因为野生型病毒从未显示出会引起人类疾病。载体颗粒的小尺寸和简单性使其可能系统性地施加高剂量的载体而不会引起急性炎性反应或毒副作用。载体基因组中适于外源DNA掺入的可利用空间是影响选择适于具体治疗应用的载体的另一标准。基于简单逆转录病毒诸如Moloney白血病病毒(MoMLV)的基因治疗载体由于其有效整合入靶细胞的基因组中而经常被选择。整合被认为是转导基因长期表达的一个先决条件。在感染的早期步骤中，逆转录病毒递送它们的核蛋白核心进入靶细胞的细胞质中。在此，病毒基因组发生逆转录，同时核心成熟为前整合复合物。该复合物必须到达核以完成病毒DNA整合进入宿主细胞染色体。对于简单逆转录病毒(致癌逆转录病毒)，此步骤需要在细胞分裂期间核膜解离，这最可能是因为蛋白质/核酸复合物的庞大尺寸阻止了它通过核孔的被动扩散，因为没有明确的定位信号来促进进入核的主动运输。目前用于人基因治疗的大部分逆转录病毒载体是有复制缺陷的并且必须在包装细胞内产生，它包含已整合的野生型病毒基因组序列并因此提供了组装病毒必需的所有结构元件，但由于包装信号序列(psi)的缺失而不能用壳体包裹它们自身的野生型病毒基因组。通常，复制缺陷型逆转录病毒载体是以每毫升只有106-7个集落形成单位(cfu)的滴度级从包装细胞产生，它几乎不适于体内转导。然而，本专利技术一般地涉及有复制能力的病毒，并且设法处理已经体外产生的病毒的不足以用于治疗的情况。为了产生足够临床级别引入动物包括人在内的用于治疗的病毒，所述病毒必须依照严格要求生产。为了生产病毒，重组病毒通常最初构建成包含病毒序列以及必要时的治疗基因的质粒。将此质粒在体外转染入细胞，并且收集和纯化由转染细胞产生的病毒，用于治疗的病毒应当具有自我复制能力。在某些情况下，期望制造不能复制的病毒，因此它们必须在包装细胞内产生。本专利技术不涉及不能自我复制的病毒。至于临床级别的病毒生产，必须培养昂贵并且技术上要求的大规模哺乳动物细胞培养物。这通常需要持续维持无菌条件、使用具有大表面面积的生物反应器(因为大多数哺乳动物细胞需要粘附于某一表面上，否则它们会凋亡)并且进行长时期的持续灌注和补充培养基(因为大多数哺乳动物细胞平均每24小时只分裂一次，所以放大过程可能花费长时间)。收获后，所述病毒必须用温和但低效的方法进行纯化，尤其是在脂质包裹的病毒诸如逆转录病毒的情况中，它们相当脆弱并且经常需要低速离心或通过体积排阻滤器的切向流过滤以减小体积并浓缩病毒制备物。虽然超速离心沉淀逆转录病毒是可能的，但通常大部分病毒颗粒由于离心而被破坏，导致总产量的显著净损失与稍微更浓缩的小体积制备物相交换。由此可见生产临床级的病毒以用于治疗可以是耗时的、昂贵的、并且最终导致低产量。因此，需要克服目前病毒治疗方法中采取的漫长培养和纯化步骤所呈现的问题。本专利技术设法通过完全去除此步骤来克服体外生产临床级病毒中的有关问题。本专利技术的专利技术人由此提出在体内细胞转染中直接应用质粒，以产生重组的有体内复制能力的病毒。本领域技术人员过去从未考虑过这样一种优秀的解决方法。与当前实践的这种显著变革构成了本专利技术的基础。具体而言，体内细胞的直接转染应考虑到在所选择的细胞类型、器官或组织内直接生产病毒并允许在低频率转染事件后定位转染靶细胞。此外，若体内产生的病毒粒子结合了靶细胞类型的向性，最初非靶细胞类型可以用所述质粒转染并且其表现为生产细胞。这明显为治疗方法提供了很大的灵活性。因此本专利技术旨在在体内细胞转染中利用编码重组且有复制能力的病毒的质粒。一旦细胞已成功地用质粒转染，将发生重组的有复制能力的病毒的表达，并且这将以预期进程导致病毒从所述细胞释放并能转染靶细胞。因此，从单一的初始质粒转染事件开始，很多靶细胞可被转染。在此首次确认了质粒可以这样的方式被应用。如先前所提及的，现有的基因治疗和病毒治疗方法集中于递送病毒自身，而使用编码病毒的质粒则非常简单，并克服了前文所论述的一些问题。因此，本专利技术的一方面提供了用于治疗的编码有复制能力的病毒的质粒。在本文中使用的术语“质粒”表示能在细胞内染色体外本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于治疗的编码有复制能力的病毒的质粒。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：笠原典之，
申请(专利权)人：纳诺非科特有限公司，
类型：发明
国别省市：GB[]