花鲈凝集素基因序列制造技术

本发明专利技术以近源物种凝集素同源基因ＣＤＳ序列的保守区设计兼并引物，从花鲈鱼的脾脏中提取总ＲＮＡ，用ＰＣＲ法扩增，结合ＲＡＣＥ技术克隆到花鲈凝集素基因的全表达序列。该基因不仅为研究鱼类凝集素在炎症反应中的作用，为进一步探讨鱼类炎症反应的发生机理奠定基础，而且通过基因序列可以获得具有生物活性的纯化蛋白，为研究新型的抗病免疫佐剂提供理论基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子生物学中基因领域，特别是关于花鲈凝集素的基因。
技术介绍
凝集素(lectin)是一种非免疫来源的能凝集细胞或沉淀含糖大分子的蛋白质或糖蛋白，一般具有糖结合专一性，能与糖蛋白或糖脂的糖相结合，其功能涉及细胞生长、分化、发育和免疫等，特别是在凝集外来细胞，参与吞噬、包囊、凝固、止血及创伤修复等方面发挥着重要的作用。随着海水养殖业的发展，病害问题日趋严重，一般的抗生素药物极易引起环境污染，因此从鱼体自身入手，提高鱼体免疫力是病害防治的趋势。非特异性防御机制在水生动物防止感染中扮演重要角色，潜在的非特异性防御机制可以在微生物入侵时发生作用，能更有效地清除、降解病原微生物和其它有害物质。大量研究表明，水生动物非特异性免疫系统在其自身抗病作用中较特异性免疫系统发挥更大作用。
技术实现思路
本专利技术的目的是通过以近源物种凝集素的基因的CDS序列的保守区设计的兼并引物，并用PCR法扩增，结合RACE技术克隆到花鲈凝集素的基因的全表达序列。该基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所述；它的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所述。本专利技术的目的通过以下技术措施实现1、总RNA的提取解剖鱼体取出脾脏，使用Trizol进行匀浆，按照使用说明提取花鲈总RNA。2、cDNA第一链的合成花鲈总RNA与反转录引物(oligo-dT接头引物)混合，进行反转录。3、引物设计依据，引物合成的方法从GenBank中下载近源物种(如人、牛、虹鳟、牙鲆、鲤鱼等)凝集素同源基因CDS序列，利用Clustal W软件进行多序列比对，确定保守区，根据保守区序列设计兼并引物，扩增片段大小约为260bp。引物设计后采用β-乙睛亚磷酰胺化学法进行DNA合成。引物序列为F5’GCAHATCCACATAGYCAACTC 3’ R5’CGAAYCTCCGCCATCG 3’4、凝集素基因PCR扩增、克隆以上述合成的第一链cDNA作为模板，用兼并引物进行PCR扩增，所扩增的PCR产物用1.2％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，从凝胶中纯化回收目的产物。然后将纯化的PCR产物克隆到pMD-18T载体中，转化大肠杆菌JM-109感受态细胞，挑取阳性克隆，提取质粒DNA。经简并引物PCR检测后，将具有插入片段的质粒DNA用M13通用引物进行双向测序。根据已得到的cDNA片段序列设计特异性引物，利用cDNA末端快速扩增技术(RapidAmplification of cDNA ends，RACE)对目的基因的3′和5′末端进行PCR扩增。在3′端的RACE中，利用基因引物和接头引物进行PCR扩增。基因引物5’CAGGAAGAGAAGAGTTCCTG 3’接头引物5’GGCCACGCGACTAGTAC 3’。经过3′端的扩增后的序列再进行5′端的RACE扩增，利用末端转移酶和dCTP在cDNA末端加上poly(C)尾后，以加尾后的cDNA作为模板，利用基因特异性引物和oligodG进行PCR扩增。oligo-dG5’GGGGGGGGGGGGGGGH 3’基因外侧引物5’TGCATGATCCAGAGTGGAAG 3’所得到的PCR产物在1.2％的琼脂糖凝胶电泳上进行分离检测后，将PCR产物纯化后，克隆到pMD-18T载体中，转化大肠杆菌JM-109感受态细胞，挑取阳性克隆，用M13引物对质粒DNA进行测序，测序所得序列再与兼并引物扩增所得的序列利用Clustal W软件进行拼接。5、对花鲈凝集素的基因的测定所得到的PCR产物在1.2％的琼脂糖凝胶电泳上进行分离检测后，将PCR产物纯化后，克隆到pMD-18T载体中，转化大肠杆菌JM-109感受态细胞，挑取阳性克隆，用3730测序仪对质粒DNA进行测序。测序结果用BLAST软件进行同源性测定，来确定为花鲈凝集素基因同源序列。本专利技术的优点本基因的获得不仅为研究鱼类凝集素在炎症反应中的作用，为进一步探讨鱼类炎症反应的发生机理奠定基础，而且通过基因序列可以获得具有生物活性的纯化蛋白，为研究新型的抗病免疫佐剂提供理论基础。附图说明图1是注射LPS刺激前后体内的不同组织器官的花鲈凝集素的表达量；No Injected注射LPS刺激前表达量；Injected with LPS注射LPS刺激后表达量；liver肝脏；spleen脾脏；gill腮；brain脑；HK头肾；heart心脏；lectin凝集素；β-actinβ-肌动蛋白。具体实施例方式1.总RNA的提取取鲜活健康花鲈(体重约400g)在实验室内暂养2d后(水温约24℃，气泵充气)，从胸腔注射脂多糖(LPS，10μg/mL)200μL。刺激6h后，解剖鱼体取出脾脏约100mg，分别放入1mL Trizol(Gibco，Japan)中进行匀浆，按照试剂盒使用说明提取总RNA。2.cDNA第一链的合成取花鲈总RNA 5μg与反转录引物(oligo-dT接头引物)1μL(10pmol/L)混合，70℃加热5min后，立即放置冰上，然后加入5×buffer，2.5mmol/L dNTP混合液，Ribonuclease Inhibitor，M-MLV反转录酶，反应体系为25μL。反应过程为42℃60min，70℃15min，最后放入-80℃保存备用。3.引物设计依据，引物合成的方法从GenBank中下载近源物种(如人、牛、虹鳟、牙鲆、鲤鱼等)凝集素同源基因CDS序列，利用Clustal W软件进行多序列比对，确定保守区，根据保守区序列设计兼并引物，扩增片段大小约为260bp。引物设计后采用β-乙睛亚磷酰胺化学法进行DNA合成。引物序列为F5’GCAHATCCACATAGYCAACTC 3’R5’CGAAYCTCCGCCATCG 3’4.凝集素基因cDNA全序列的克隆以近源物种凝集素基因CDS序列的保守区设计的兼并引物，扩增片段大小约为260bp。以上述合成的第一链cDNA作为模板，用兼并引物进行PCR扩增，反应体系为10×PCR反应缓冲液5μL，25mmol/L MgCl23μL，2.5mmol/L dNTP 2μL，10nmol/L引物dTF和dTR各2μL，Taq酶1.25U，用PCR水将反应体系补充至50μL。反应条件为1个循环，94℃变性5min；35个循环94℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸45s；1个循环，72℃延伸10min；4℃保温。所扩增的PCR产物用1.2％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，从凝胶中纯化回收目的产物。然后将纯化的PCR产物克隆到pMD-18T载体中，转化大肠杆菌JM-109感受态细胞，挑取阳性克隆，提取质粒DNA。经简并引物PCR检测后，将具有插入片段的质粒DNA用M13通用引物进行双向测序。根据已得到的cDNA片段序列设计特异性引物。利用cDNA末端快速扩增技术(RapidAmplification of cDNA ends，RACE)对目的基因的3′和5′末端进行PCR扩增。在3′端的RACE中，利用基因特异性引物和接头引物进行PCR扩增。反应体系为10×PCR反应缓冲液5μL，25mmol/L MgCl23μL，2.5mmol/L dNTP2μL，10nmol/L正反向引物各2μL，Taq酶1.25U，用PCR水将本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种花鲈凝集素基因，它的核苷酸序列如序列表中ＳＥＱＩＤＮＯ．１所述。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：江世贵，邱丽华，张汉华，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院南海水产研究所，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]