具有减毒日本脑炎病毒基因作为主链的减毒嵌合黄病毒制造技术

包含编码日本脑炎病毒的衣壳蛋白、前膜蛋白和非结构蛋白的核苷酸序列，和编码第二个黄病毒的包膜蛋白的核苷酸序列的核酸分子，其中编码日本脑炎病毒的前膜蛋白和／或非结构蛋白的核苷酸序列具有产生至少一个能减毒病毒的氨基酸突变的核苷酸突变。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及具有减毒日本脑炎病毒基因作为主链的减毒嵌合黄病毒，其作为用于预防黄病毒感染的减毒的活疫苗是有用的。
技术介绍
目前，已知超过大约60种属于黄病毒科(Flaviviridae)的病毒(以下简称黄病毒)，包括日本脑炎病毒、西尼罗病毒、登革1-4病毒、黄热病毒、圣路易脑炎病毒、蜱传脑炎病毒、库宁病毒(Kunjin virus)、中欧脑炎病毒、贾萨努尔森林病毒、墨累山谷脑炎病毒、鄂木斯克出血热病毒、玻瓦散病毒、俄罗斯春夏季脑炎病毒、Yokose病毒、Apoi病毒和Aroa病毒。这些黄病毒具有单链(+)RNA的基因组，并在基因结构方面互相类似。黄病毒基因组的可读框(ORF)由其5′末端开始编码三个结构蛋白(衣壳(C)蛋白、前膜(prM)蛋白，其为膜(M)蛋白的前体、和包膜(E)蛋白)和随后的七个非结构(NS)蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)。黄病毒的这些结构蛋白和非结构蛋白被翻译成单个多蛋白；翻译的多蛋白然后被蛋白酶和具有宿主细胞和病毒的蛋白酶活性的NS3蛋白加工，从而导致形成包含上面所述的三种结构蛋白的成熟病毒体。众所周知许多上面所述的黄病毒经由昆虫例如蚊子和蜱来感染哺乳动物，包括人类和鸟类，并引起脑炎和/或发热症状。起初，这些黄病毒物种的每一种都固有于特定的区域；因此，限制了感染的地方范围。但是，近年来，由于交通/分配的发展、气候变化等，各种黄病毒感染已经扩展到病原黄病毒的最初生境以外的地方，从而引起了公共卫生的重要的问题。在防止病毒感染的扩展中，用疫苗来预防是有效的。然而，尽管如上所述已经识别了属于黄病毒科的很多病毒，但是在实际应用中仅仅将用于黄热病毒和日本脑炎病毒感染的减毒活疫苗和用于日本脑炎病毒和蜱传脑炎病毒感染的灭活疫苗作为用于黄病毒感染的疫苗。尤其是，减毒活疫苗作为廉价的疫苗是有用的并诱导长期免疫性，但是除了如上所述的那些疫苗以外还没有批准活疫苗。在这些情况下，作为快速开发新的用于各种黄病毒感染的减毒活疫苗的方法，最近一种应用由基因工程技术制备的嵌合黄病毒的策略已经引起大家的注意。例如，ChimeriVaxTM-JE是通过将编码黄热病毒疫苗17D毒株的两个结构蛋白(prM-E)的基因替换为日本脑炎病毒疫苗SA14-14-2毒株的相应基因来制备的嵌合黄病毒(参见，例如，国际专利公开号No.98/37911的小册子和国际专利公开号No.01/39802的小册子)。通过存在于与日本脑炎病毒疫苗SA14-14-2毒株的E蛋白相应的病毒多蛋白中的来自野生型的大量氨基酸突变，将ChimeriVaxTM-JE减毒到允许其用作疫苗的程度(参见，例如，Arroyo等人，J.Virol.75934-942，2001)。此外，基于这个ChimeriVaxTM-JE的技术，也已经开发了登革1-4病毒的嵌合黄病毒(ChimeriVaxTM-DEN(1-4))(参见，例如，国际专利公开号No.98/37911的小册子和国际专利公开号No.01/39802的小册子)，以及西尼罗病毒的嵌合黄病毒(ChimeriVaxTM-West Nile)(参见，例如，国际专利公开号No.2004/045529的小册子)，其具有黄热病毒疫苗17D毒株的基因作为主链。还将这些嵌合黄病毒减毒到允许其用作疫苗的程度，所述减毒主要由存在于与prM-E蛋白相应的病毒多蛋白中的来自野生型的氨基酸取代所导致。但是，已经报道了ChimeriVaxTM-DEN1的减毒主要由在用于疫苗生产的细胞中的该嵌合黄病毒的传代中发生的E蛋白的氨基酸突变导致(参见，例如，Guirakhoo等人，J.Virol.789998-10008，2004)。此外，因为不同血清型的登革病毒的再感染可能是登革出血热发作的原因，所以没有发现该疫苗的实际应用。同样，已经通过在来源于野生型高毒性的西尼罗病毒NY-99毒株的E蛋白中人工导入氨基酸突变来促进ChimeriVaxTM-West Nile减毒(参见，例如，国际专利公开号No.2004/045529的小册子)。作为使用除黄热病毒(YF-17D)以外的基因主链的嵌合黄病毒，已经报道了通过将编码登革-4病毒prM-E蛋白的基因替换为西尼罗病毒NY99毒株的相应基因来制备的嵌合黄病毒(WN/DEN4嵌合病毒)(参见，例如，Pletnev等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 993036-3041，2002)。虽然WN/DEN4嵌合病毒与其亲本毒株(即西尼罗病毒和登革4病毒)相比是减毒的，但是减毒的机理还没有被充分地阐明，并且没有发现该病毒作为疫苗的实际应用。
技术实现思路
当按照如上所述的常规方法来开发用于各种黄病毒感染的减毒活嵌合黄病毒疫苗时，必须研究安全性，即，对黄病毒物种的每一组合构建的嵌合病毒的脑神经毒性、从外周向中枢神经系统的感染性(脑神经侵袭力)、防止感染的作用、中和抗体产生等，并且这可能是延长减毒活疫苗实际应用时间段的主要原因。此外，活疫苗当为了安全性进行减毒时还引起了抗体生产力降低的问题。这是因为通过如上所述修饰E蛋白来进行的病毒的减毒可能降低了其作为疫苗的免疫诱导潜力(抗体生产力)，因为诱导中和抗体的抗原决定簇存在于E蛋白中。因此，本专利技术的目标是提供在除E蛋白以外的部分具有减毒突变的减毒嵌合黄病毒。本专利技术人进行坚持不懈地研究来解决以上所述的问题，发现用于猪的日本脑炎病毒疫苗ML-17毒株具有在除E蛋白以外的prM和NS蛋白中大量的对于ML-17毒株固有的氨基酸突变，并且获得了这些氨基酸突变可能涉及ML-17毒株减毒的暗示。根据这个发现，本专利技术人被启发来构建具有包含对于ML-17毒株固有的一个或多个氨基酸突变的日本脑炎病毒的除E蛋白以外的结构蛋白和非结构蛋白(即C蛋白、prM蛋白和NS蛋白)的嵌合黄病毒，进行进一步的研究，并开发了本专利技术。因此，该本专利技术提供了包含编码日本脑炎病毒的衣壳蛋白、前膜蛋白和非结构蛋白的核苷酸序列，和编码第二个黄病毒的包膜蛋白的核苷酸序列的核酸分子，其中编码日本脑炎病毒的前膜蛋白和/或非结构蛋白的核苷酸序列包含产生一个或多个减毒病毒的氨基酸突变的核苷酸突变。在中所述的核酸分子，其中所述日本脑炎病毒是ML-17毒株。在或中所述的核酸分子，其中所述第二个黄病毒选自西尼罗病毒、登革1-4病毒、黄热病毒、圣路易脑炎病毒、蜱传脑炎病毒、库宁病毒、中欧脑炎病毒、贾萨努尔森林病毒、墨累山谷脑炎病毒、鄂木斯克出血热病毒、玻瓦散病毒、俄罗斯春夏季脑炎病毒、Yokose病毒、Apoi病毒和Aroa病毒。由在到任何一项中所述核酸分子编码的减毒嵌合黄病毒。包含在中所述的减毒嵌合黄病毒的减毒活疫苗。制备在中所述核酸分子的方法，其包含下列步骤将在包含编码日本脑炎病毒的核苷酸序列的核酸分子中编码包膜蛋白的核苷酸序列替换为编码第二个黄病毒的包膜蛋白的核苷酸序列的步骤；和将产生一个或多个减毒病毒的氨基酸突变的核苷酸突变导入编码日本脑炎病毒的前膜蛋白和/或非结构蛋白的核苷酸序列中的步骤。制备在中所述核酸分子的方法，其包含下列步骤将在包含编码日本脑炎病毒的核苷酸序列的核酸分子中编码包膜蛋白的核苷酸序列替换为编码第二个黄病毒的包膜蛋白的核苷酸序列的步骤，所述日本脑炎病本文档来自技高网...

【技术保护点】
包含编码日本脑炎病毒的衣壳蛋白、前膜蛋白和非结构蛋白的核苷酸序列，和编码第二个黄病毒的包膜蛋白的核苷酸序列的核酸分子，其中编码日本脑炎病毒的前膜蛋白和／或非结构蛋白的核苷酸序列包含产生一个或多个减毒病毒的氨基酸突变的核苷酸突变。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：森田公一，锅岛武，三宅信一，大西敏之，福家功，石川丰数，合田英雄，石桥正英，高桥理明，
申请(专利权)人：财团法人阪大微生物病研究会，
类型：发明
国别省市：JP[日本]