本发明专利技术主要涉及由人促黄体生成激素释放因子衍生物（ＧｎＲＨ）和假单胞菌外毒素Ａ的缺失体ＰＥ４０或ＰＥ３８及其突变体串联组成的融合蛋白，本发明专利技术重点对ＬＨＲＨ的Ｎ末端５，７，８位氨基酸进行了突变，使得突变后的融合蛋白与已知的该类靶向融合蛋白相比具有更强的肿瘤细胞亲和性和特异杀伤性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物基因工程中的导向融合蛋白领域，目前癌症仍然是死亡率位居第二的疾病，目前人们还没有特别有效的手段来进行治疗，化疗仍然是目前最常用的治疗方法，虽然有一定的疗效，但是其副作用大，治疗效果只有部分理想，治疗时容易产生耐药株癌细胞等缺点影响了这种方法的疗效和有效率。 导向治疗是一种有望代替化疗的新的治疗手段，有多篇文献和专利(中国专利应用嵌合毒素诊断癌症的方法，99806580.3；中国专利一种能特异杀死肿瘤细胞的基因工程重组蛋白，03137587.1；中国专利高效低毒的系列功能蛋白，200410033621.6)报道了关于使用人促黄体激素释放因子及其衍生物作为靶向融合蛋白的导向部分，但是其存在着与GnRH受体亲和力低，靶向性差，从而存在非特异性毒性高的特点。本专利技术通过选用人促黄体激素释放因子衍生物作为导向，选用PE40和PE38及其的KDEL衍生物作为毒素部分，得到了与现有已知的人促黄体生成激素释放因子-假单胞杆菌毒素A(即GnRH-PE)类靶向融合分子相比，受体亲和性特异性和活性大大提高的基因工程融合蛋白，在肿瘤治疗方面有很高的应用价值。 二.
技术介绍
目前癌症的治疗仍然是一个难题，人们应用的主要的治疗手段仍然是手术，放疗和化疗，传统的治疗法在带来疗效的同时，副作用也往往很大，并且对于复发的肿瘤治疗效果更加有限。传统的疗法的缺点主要在于其在杀死肿瘤细胞的同时也大量地杀死了正常细胞，导向治疗的出现使我们有可能对肿瘤细胞实现导向治疗，即药品分子可以导向地到达肿瘤细胞并发挥作用，达到导向治疗的效果。目前免疫毒素或导向毒素是达到导向治疗的一个重要的发展方向，通过特异性抗体或细胞因子、激素等与毒素连接，前者作为导向部分，即配体，可以引导分子到达肿瘤部位并与肿瘤细胞表面的过量表达的该种受体结合，后者作为毒素部分，即杀灭肿瘤细胞的部分。目前以GnRH或其衍生物为导向部分，PE40及其衍生物为毒素部分的靶向治疗剂已经有报道(中国专利应用嵌合毒素诊断癌症的方法，99806580.3；中国专利一种能特异杀死肿瘤细胞的基因工程重组蛋白，03137587.1；中国专利高效低毒的系列功能蛋白，200410033621.6)，但其存在与GnRH受体的亲和性不强，稳定性差的缺点，导致了其作为肿瘤的治疗剂具有特异性差，非特异性毒性强的特点，所以目前该类分子还无法作为有效的肿瘤治疗药物进行应用。 三.
技术实现思路
本专利技术涉及一种GnRH-PE本专利技术人通过对已知GnRH-PE融合蛋白进行蛋白质三级结构分析，采用基因工程方法对所述蛋白质的N-末端作为导向的GnRH加以修饰，通过大量的筛选，出人意料的获得了在靶向性方面明显优于现有GnRH-PE衍生物的新的GnRH-PE衍生物。 本专利技术中的GnRH-PE衍生物包括将天然人促黄体生成激素释放因子的第5位氨基酸突变为His，第6位突变为Trp，第7位突变为Trp，第8位突变为Leu所得到的(His5，Trp6，Trp7，Leu8)GnRH-PE衍生物和将天然人促黄体生成激素释放因子的第五位氨基酸突变为His，第7位突变为Trp，第8位突变为Leu所得到的(His5，Trp7，Leu8)GnRH-PE衍生物，这两种衍生物具有高亲和性，高特异性的特点。 通过上述专利技术得到的靶向融合蛋白具有高活性，受体高亲和性和高特异性的特点，对肿瘤细胞具有特异性杀伤作用，是潜在的肿瘤治疗药物。 本专利技术的一个方面，涉及一种GnRH-PE衍生物，其分别为SEQ ID NO1所示的(His5，Trp6，Trp7，Leu8)GnRH-PE40，SEQ ID NO2所示的(His5，Trp6，Trp7，Leu8)GnRH-PE38，NO3所示的(His5，Trp6，Trp7，Leu8)GnRH-PE40KDEL，NO4所示的(His5，Trp6，Trp7，Leu8)GnRH-PE38KDEL，以及SEQ ID NO5所示的(His5，Trp7，Leu8)GnRH-PE40，SEQ ID NO6所示的(His5，Trp7，Leu8)GnRH-PE38，NO7所示的(His5，Trp7，Leu8)GnRH-PE40KDEL，和NO8所示的(His5，Trp7，Leu8)GnRH-PE38KDEL。 本领域普通技术人员知晓，所述上述融合蛋白可以通过基因重组表达的方法或者化学合成的方法制备。在本专利技术中，所述GnRH-PE衍生物是通过基因工程重组表达的方法获得的。 在本专利技术的一个实施方案中，通过如下方法获得GnRH-PE衍生物，包括如下步骤 1)表达载体的构建 依据已知氨基酸序列(SEQ ID NO1)，选用大肠杆菌偏好密码子全基因合成基因序列，同时在相应于所编码的氨基酸序列之N末端和C末端加上限制性酶切位点。 应用PCR的方法对SEQ ID NO1的基因序列进行N-末端突变和C末端突变，得到编码SEQ ID NO2-8的融合蛋白的核酸序列。 再分别将如上述制备的GnRH-PE衍生物序列以及筛选质粒pBSK用限制性内切酶处理好，经计算各样品浓度后按一定摩尔比加入T4连接体系。经转化、筛选成功的重组子。 用限制性酶切下融合蛋白基因，再将该基因与用限制性酶处理好的NOVAGEN公司质粒pET21b连接，经筛选得到正确地重组子。 2)重组靶向融合蛋白的表达及分离纯化 将如上述所得重组子转化到表达宿主菌，经表达筛选出高表达基因工程菌，然后经发酵，得到目的蛋白高表达的工程菌。使用渗透压方法破碎细菌，然后经过离心、澄清的步骤，通过一系列常用的层析方法，如离子交换，凝胶过滤和疏水层析等，纯化最终得到纯度大于95％的目的蛋白。 3)目的蛋白生物活性的测定用MTT法，首先对Hela细胞进行消化和收集，将细胞用RPMI1640培养液稀释成6-8×104个/毫升的细胞悬液，接种于96孔板，100ul/孔，37度培养4小时。对照加入100ul培养液。样品先用RPMI 1640培养液稀释成100ul/mL，作为起始孔，然后按每孔与上孔2.5倍的关系稀释样品，各加入稀释的样品每孔100ul，37度，培养24小时，取出，用MTT法染色，用酶标仪570nm进行测定并计算IC50值。 4)目的蛋白与GnRH受体的亲和性测定 制备胎盘质膜，取胎盘绒毛，于冰冷的25mM PB，pH7.4，1mM MgCl2中匀浆，过滤，并且10000g，离心20min，去上清，沉淀用上述缓冲液洗一次，再10000g，离心15min，沉淀按湿重60mg/mL的比例悬浮于上述缓冲液中备用，用Lowry法定蛋白浓度。靶向融合蛋白的碘标记在1.5mL的doff管中加入3.8×107Bq Na125I，20uL0.5M PB，pH7.5，500ug靶向融合蛋白，2.3mU乳过氧化氢酶β-D(+)-葡萄糖开始反应，20℃反应10min，然后加入50uL0.1M硼酸缓冲液pH9.2终止反应。然后使用1mL的Q Sepharose High Performance进行层析纯化。结合试验聚丙烯管内加入100uL已标记的GnRH-PE40和100uL已标记的靶向融合蛋白，100uL 25mM PB，pH7.4，1mM MgCl2，0.2％BSA，100uL本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基因工程重组融合蛋白，其特征是由人促黄体生成激素释放因子衍生物（ＧｎＲＨ）和假单胞菌外毒素Ａ的缺失体ＰＥ４０或ＰＥ３８及其突变体串联组成的融合蛋白，上述专利技术的融合蛋白与已知的该类靶向融合蛋白相比具有更强的肿瘤细胞亲和性和特异杀伤性。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王桂有，赵自育，陈海军，陆学山，
申请(专利权)人：合肥丽湖医药科技开发有限公司，
类型：发明
国别省市：34[中国|安徽]
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