本发明专利技术涉及表达构建体及其合成方法，在它们转染进入真核细胞后，在这些细胞内适合以ＲＮＡ干扰以靶向方式抑制指定蛋白质的形成。在一个反应容器中，制备这种载体的不包含ＰＣＲ步骤的方法是３步法并且可在几小时内完成。此外，本发明专利技术涉及适合以ＲＮＡ干扰靶向抑制基因表达的ＤＮＡ表达构建体，其中这些表达构建体也适合于多基因表达抑制。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】以RNA干扰特异性抑制基因表达的DNA构建体描述本专利技术涉及制备载体的方法以及这些载体，在所述载体转染进入真核 细胞之后，其适合于通过RNA干扰以靶向方式抑制一或几种蛋白质的形成。近来， 一种抑制基因表达的可能性是基于合成双链RNA分子。使用这 种双链RNA (dsRNA)与任何其他方法相比，各个基因可被非常有效地和 更快速地以靶向方式关闭，而无需破坏邻近基因的蛋白质形成。其基本原 理被命名为RNA干扰，縮写为RNAi。产生该现象的dsRNA序列被命名为 siRNA (小干扰RNA)。SiRNA不能防止基因被读出但是可以打开细胞机制，该机制防止从基 因读出的mRNA分子产生并因此阻止相应蛋白质的形成(转录后基因沉 默)。由19至23个RNA碱基长的短siRNA分子触发mRNA的这种耙向降 解，该siRNA与转录为被抑制的蛋白质的耙mRNA同源。siRNA分子组合 特异性内切核糖核酸酶形成一个细胞的RNA蛋白复合体，称为"RISC" (RNA诱导的沉默复合体)。当这些复合体形成，RNA双链解离，导致每 个均含有单链siRNA分子的所谓的活化的RISC。含有与耙mRNA互补的 反义链的活化RISC与靶mRNA结合，RNA-蛋白质复合体的内切核糖核酸 酶确保序列特异性降解mRNA。采用实验方法在细胞内产生siRNA或者从外部将其转入。通过体外或 体内给予合成制备的siRNA分子来完成这些实验。但是，该方法具有技术限制。合成的siRNA在培养基和细胞内通常不 稳定，原则上，使用合成的siRNA的抑制作用可能只是暂时的，许多细胞 (例如神经细胞)可被非常无效率地转染。因此基于合成siRNA转染的研 究限制在时间上(从1到5天)和细胞类型上。此外，高生产成本和长时间生产也是不利因素。其他方法是在细胞内通过载体产生siRNA。它们是病毒载体或基于质 粒的载体，其一旦进入到细胞内就可表达形成siRNA序列。与转染合成 siRNA比较，其优势在于更稳定和更可调控相应siRNA序列的转录。但是，基于质粒的载体不仅表现出低转染效率，而且具有一个精细的 生产过程。因此需要选择稳定的克隆。通常这个过程冗长并需要花费数周 甚至数月，并且频繁出现克隆实验固有的大量潜在的困难。用于检测产物 的测序程序也是费力和昂贵的。此外，基于质粒的载体含有选择所必需的抗生素抗性基因。因此，这 个载体不适合应用于活的生物体。与无处不在的细菌可能的重组导致在有 机体内出现对抗生素具有抗性的细菌的风险增加。抗生素抗性的传播是一 严重问题，这一途径是不可靠的。因为病毒载体能够有效和靶向转染，与合成siRNA分子和基于质粒的 载体比较，它们具有一定的优势。但是，对于治疗应用仅能有条件的使用这样的病毒载体。在此，病毒 序列与天然存在病毒的重组表现出一个固有的安全风险，因此必须小心不 要创造一个新的致病性杂种病毒。另外，它们的制备也是精细和昂贵的。甚至使用表达系统抑制仅仅一个基因产物的表达也与大量复杂情况相 关，在细胞或组织内同时关闭几个基因产物的表达是更加复杂而因此更难 实现这几乎是公认的。当使用几个独立的构建体时，通过RNA干扰多重抑制基因表达的一个 主要问题是细胞仅将被一个构建体转染的可能性低。这个低可能性随使用 的构建体数而呈指数的降低。但是，对于遗传治疗的某些方法，需要一个 可控的和同时的基因表达抑制。存在的大量方法能在细胞内共转录几个RNA分子。最简单的方法是共 转染2个独立的表达构建体(以下也称为载体)。另一个方法由转染携带2 个独立表达盒的载体组成。这样的构建体也可被用于合成siRNA分子。但是，这2种可能性具有风险，即转录物在数量、加工、半衰期和翻 译效率显著不同以及在蛋白质表达量也显著不同，结果是其应用的特征是无效性和低重复性。因此，这种表达系统的使用也会导致不同程度的siRNA 转录，将最终产生相关基因的不平衡抑制。使用IRES (内部核糖体进入位点)元件构建双顺反子和多顺反子RNA 分子代表另一种共表达几个基因的可能性。它们允许通过序列元件由核糖 体起始翻译，而与mRNA帽子结构无关。IRES元件最早在小RNA病毒的 mRNA中被发现(Pelletier and Sonenberg， 1988， Nature 334: 320-325， Jang et al., 1988, Journal Virology 62: 2636-2643)。构建双顺反子载体时，最常使用脊髓灰质炎病毒和EMCV (脑心肌炎 病毒)的IRES元件(Dirks etal.， 1993, Gene 128:247-249)。不幸的是，它 们的效率很大程度依赖于使用的细胞系而变化较大(Bomian et al.， 1997， Nucleic Acids Res. 25: 925-932)。大多数可使用的双顺反子表达盒由排列在IRES元件3'侧的可选择标 记物或报道基因和插入所需基因的MCS (多克隆位点)组成(Dirks et al.， 1993, Gene 128: 247-249)。使用IRES元件的三顺反子和多顺反子表达系统 也是已知的(Zitvogel et al" 1994, Hum Gene Ther 5: 1493-1506, Fussenegger et al" 1998a， Nature Biotechnol. 16: 468-472, Mielke et al" 2000， Gene 254. 1-8)。但是，对于治疗应用仅能有条件的使用病毒IRES元件。在此，病毒序 列与天然存在病毒的重组表现出一个固有的安全风险，因此必须小心不要 创造一个新的致病性杂种病毒。通过连接无IRES元件的转录单元也可构建多顺反子载体。 一方面，通 过不同MCS插入质粒载体可以克隆所需基因，另一方面，通过DNA接头 连接从质粒分离的表达盒形成线性多顺反子载体(Tsang et al.， 1997， Bio Techniques 22: 68)。但是，线性顺式连接基因表达率的研究显示对这种方式排列的表达盒 转录存在较强的负面影响(Esperet et al.， 2000, J Biol Chem 275: 25831-25839)。表达多基因的质粒载体在克隆的转录单位数量上不同于常规质粒载 体。在本文中，相同或不同来源的启动子或poly(A)序列可被用于转录单位。使用不同启动子时出现的不利因素是由于启动子的强度不同而因此各个基因的表达率改变，而使用相同启动子可导致DNA二级结构的形成，其 结果是可能导致启动子功能丧失。所有提及的多基因表达载体共同的是它们是基于质粒或病毒载体。除 了所有目前多编码载体所描述的缺陷以外，另外它们表现出这类载体的不 利因素。病毒载体的不利因素(包括减毒疫苗株的不稳定性)和质粒DNA 载体的缺陷(例如伴随使用过程中抗生素抗性基因的传播(在EP0941 318 Bl中详细描述))充分己知。因此，需要siRNA表达系统也能够同时抑制几个基因的基因表达。或 许解决这个问题的最大难题是连接序列以产生siRNA分子的接头，其确保 在每种情况中充分的转录以抑制这些序列的基因表达。从文献已知一个使用DNA连接元件连接DNA片段的方法。Seema本文档来自技高网...
【技术保护点】
通过ＲＮＡ干扰靶向抑制基因表达的ＤＮＡ表达构建体，其由以下成分组成：ａ）第一末端ＤＮＡ发夹环，其中脱氧核糖核苷酸的一条单链向后折叠形成双链区以至后者在一个末端具有粘性突出端而在相对末端具有单链环；ｂ）与第一末端发夹环相似地构建第二末端发夹环；ｃ）具有通过霍利迪连结体相互连接的三个双链ＤＮＡ臂的至少一个Ｔ形ＤＮＡ结构，其中ｉ．一条臂含有待转录序列并且这个ＤＮＡ双链臂的单链在与其他臂连接相对的末端通过单链ＤＮＡ环相互连接；ｉｉ．其他２个臂呈现粘性末端，其中一条臂呈现适合的终止序列而另一臂呈现适合的启动子序列。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：M施罗夫，D奥斯拉德，
申请(专利权)人：莫洛根股份公司，
类型：发明
国别省市：DE[德国]
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