可视化LAMP检测铜绿假单胞菌的引物组、试剂盒及方法技术

本发明专利技术公开了一种可视化LAMP检测铜绿假单胞菌特异性基因的引物组、试剂盒及方法，该引物组包括一对外引物、一对内引物和一对环引物。检测试剂盒包括引物组、标准靶片段、反应液、DNA聚合酶和染料。其检测方法是通过提取待检测样品的基因组DNA后，将DNA模板加入到试剂盒的各混合组分中，在一定温度下对样品模板进行扩增，通过扩增产物的颜色判断样品中铜绿假单胞菌阳性或阴性结果。通过上述方式，本发明专利技术具有灵敏度高、特异性高、可视化判断及步骤简单作等特点。

【技术实现步骤摘要】
可视化LAMP检测铜绿假单胞菌的引物组、试剂盒及方法
本专利技术属于生物检测
，涉及食品安全和动物疾病的检测方法，特别是涉及一种可视化LAMP检测铜绿假单胞菌的引物组、试剂盒及方法。
技术介绍
铜绿假单胞菌是一种在自然界广泛存在的机会主义革兰氏阴性杆菌，能导致各种临床感染并引起严重的传染疾病。铜绿假单胞菌也是一种常见的食源性致病菌，可以通过污染食品而造成食物中毒。据世界卫生组织报道，世界范围内每年发生40～60亿例食源性腹泻，微生物是引起食源性腹泻的主要因素，食品安全日益成为人们关注的焦点。在食品检测中，世界卫生组织已将铜绿假单胞菌作为饮用水的检测指标，欧共体和国际食品法典委员会都明确规定水中不得检出铜绿假单胞菌。由于铜绿假单胞菌在浓度很低的时候就能引起感染，因此食品高灵敏检测及疾病早期检测对于预防铜绿假单胞菌引起的感染至关重要。一直以来，科学家们都在致力于建立快速、高灵敏度的铜绿假单胞菌检测方法。尽管到目前为止已经发展出如流式细胞术、免疫学检测法及分子生物学检测法等多种现代检测手段，但是目前临床上最常用的方法仍然是传统的培养方法，这也说明了这些新方法要想在临床上应用还存在一定的不足，需要进一步改进。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供可视化LAMP检测铜绿假单胞菌的引物组、试剂盒及方法，实现铜绿假单胞菌快速、可视化检测。本专利技术的目的通过以下技术方案来实现：本专利技术主要解决的技术问题是提供可视化LAMP检测铜绿假单胞菌的引物组、试剂盒及方法，该检测试剂盒提供的方法是通过扩增产物的颜色判断样品中铜绿假单胞菌阳性和阴性结果。本专利技术具有灵敏度高、特异性高、可视化判断及步骤简单作等特点。为解决上述技术问题，本专利技术采用的一个技术方案是提供可视化LAMP检测铜绿假单胞菌的引物组、试剂盒及方法。本专利技术所采用的技术方案如下：可视化LAMP检测铜绿假单胞菌特异性基因gyrB的引物组，包括一对外引物、一对内引物和一对环引物，其核苷酸序列分别如下所示：gyrB-F3：GGAGGAGCTGTTCAAGTACG(SEQIDNO.1)gyrB-B3：AACCGGCCAGGTGGGT(SEQIDNO.2)gyrB-FIP：TTCACGCTGGACGTTGAAGTGG-CTGAAGGCCTTCGTCGAGTA(SEQIDNO.3)gyrB-BIP：CGTGGGTGTGGAAGTCGCC-TGTTGTTGGTGAAGCAGAGC(SEQIDNO.4)gyrB-LF：CGGTCTTGTTGGTGTTCAGG(SEQIDNO.5)gyrB-LB：CAGTGGAACGACAGCTTCAACGAG(SEQIDNO.6)上述引物组SEQIDNO.1-SEQIDNO.6在可视化LAMP检测铜绿假单胞菌中的应用。可视化LAMP检测铜绿假单胞菌的试剂盒，该检测试剂盒包括上述特异性基因gyrB的引物组SEQIDNO.1-SEQIDNO.6。可视化LAMP检测铜绿假单胞菌的试剂盒，还包括以下成分：(1)染料；(2)BstDNA聚合酶；(3)反应液；(4)标准靶片段。上述试剂盒在可视化LAMP检测铜绿假单胞菌中的应用。上述可视化LAMP检测铜绿假单胞菌的试剂盒，其特征在于引物组包含F3和B3引物浓度均为5μM/L，BIP和FIP引物浓度均为40μM/L，LB引物浓度均为10μM/L。引物的比例如下：外引物(F3和B3)、内引物(FIP和BIP)、环引物(LF和LB)的摩尔比为：1∶8∶2。上述可视化LAMP检测铜绿假单胞菌的试剂盒，其特征在于：所述LAMP反应液含有：10mM/LdNTPMix、10×BstDNA聚合酶缓冲液及100mmol/LMgSO4，250mmol/L甜菜碱，三者的体积比是7∶5∶3∶2。上述可视化LAMP检测铜绿假单胞菌的试剂盒，其特征在于：所述标准靶片段是用T载体构建含有靶基因片段的标准载体。上述可视化LAMP检测铜绿假单胞菌的试剂盒，其特征在于：所述染料为3.5mmol/L的镁试剂I溶液。可视化LAMP检测铜绿假单胞菌的方法，它包括以下步骤：S1.提取待测样本基因组DNA为模板；S2.配置LAMP检测体系铜绿假单胞菌可视化检测体系为25μL。具体包括：上述引物组混合液1μL，BstDNA聚合酶8U，反应液8.5μL，样本基因组DNA模板1μL，然后用无菌去离子水补足至25μL。以标准靶片段代替样本基因组DNA模板为阳性对照，以无菌水代替样本基因组DNA模板为阴性对照。S3.LAMP反应将S2的LAMP检测体系于60-65℃反应30-60分钟，再在80℃反应2分钟；S4.显色反应及结果读取；S5.所述的LAMP反应结束后，加入权利要求4和权利要求9所述的染料1.5μL，混匀，保持3-5分钟；S6.根据颜色变化判断结果；其中，黄色表示阴性，紫红色表示阳性。附图说明图1是该试剂盒灵敏度测试图；图2是该试剂盒特异性测试图。具体实施方式本专利技术提供铜绿假单胞菌的可视化检测试剂盒，为使本专利技术的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本专利技术进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。实施例1铜绿假单胞菌的可视化检测试剂盒的建立。铜绿假单胞菌的可视化检测试剂盒，包括引物组、反应液、BstDNA聚合酶、标准靶片段和染料。(1)引物组：以铜绿假单胞菌gyrB基因为靶基因，ecfX基因为内标基因，利用在线设计软件PrimerExplorerversion4进行引物的设计。gyrB基因检测引物组，包括一对外引物、一对内引物和一对环引物，其核苷酸序列分别如下所示：gyrB-F3：GGAGGAGCTGTTCAAGTACG(SEQIDNO.1)gyrB-B3：AACCGGCCAGGTGGGT(SEQIDNO.2)gyrB-FIP：TTCACGCTGGACGTTGAAGTGG-CTGAAGGCCTTCGTCGAGTA(SEQIDNO.3)gyrB-BIP：CGTGGGTGTGGAAGTCGCC-TGTTGTTGGTGAAGCAGAGC(SEQIDNO.4)gyrB-LF：CGGTCTTGTTGGTGTTCAGG(SEQIDNO.5)gyrB-LB：CAGTGGAACGACAGCTTCAACGAG(SEQIDNO.6)(2)标准靶片段标准靶片段是用于阳性对照的标准载体。用T载体构建含有靶基因片段的标准载体的方法为：将含引物组扩增序列的gyrB基因片段利用常规方法连接到T载体中，得到用于阳性对照的标准载体。(3)检测方法：1)待检样品的提取：按照DNA提取试剂盒进行。2)铜绿假单胞菌的可视化检测试剂盒用于铜绿假单胞菌可视化检测的扩增反应体系，其中25μL的反应体系为：引物组混合液1μL，BstDNA聚合酶8U，反应液8.5μL，样本DNA1μL，染料1.5μL，然后用无菌去离子水补足至25μL。以标准靶片段1μL代替样本DNA为阳性对照，以去离子无菌水1μL代替样本DNA为阴性对照。配制好的反应体系在PCR管混匀后，于63℃反应30-90分钟，并在80℃反应2-3分钟。然后观察颜色试管颜色变化，判定检测结果。实施例2铜绿假单胞菌的可视化检测试剂盒灵敏度测试首先用常规方法培养铜绿假单胞菌，然后通过平板培养计数获得本文档来自技高网...

【技术保护点】
可视化LAMP检测铜绿假单胞菌的引物组，其特征在于，所述铜绿假单胞菌基因为gyrB基因；其中，所述gyrB基因的引物组包括一对外引物、一对内引物和一对环引物，外引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，内引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，环引物序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

【技术特征摘要】
1.可视化LAMP检测铜绿假单胞菌的引物组，其特征在于，所述铜绿假单胞菌基因为gyrB基因；其中，所述gyrB基因的引物组包括一对外引物、一对内引物和一对环引物，外引物序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示，内引物序列如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示，环引物序列如SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示。2.如权利要求1所述的引物组在铜绿假单胞菌可视化检测上的应用。3.可视化LAMP检测铜绿假单胞菌的试剂盒，其特征在于，包含如权利要求1所述的引物组。4.根据权利要求3所述的可视化LAMP检测铜绿假单胞菌的试剂盒，其特征在于，还包括以下成分：(1)染料；(2)BstDNA聚合酶；(3)反应液；(4)标准靶片段。5.如权利要求3或4所述的试剂盒在可视化LAMP检测铜绿假单胞菌中的应用。6.根据权利要求4所述的可视化LAMP检测铜绿假单胞菌的试剂盒，其特征在于，每个引物组混合液中包含F3和B3引物浓度均为5μM/L，BIP和FIP引物浓度均为40μM/L，LB引物浓度均为10μM/L；其中，外引物(F3和B3)、内引物(FIP和BIP)、环引物(LF和LB)的摩尔比为：1∶8∶2。7.根据权利要求4所述的可视化LAMP检测铜绿假单胞菌的试剂盒，其特征在于，所述反应液含有：10mM/LdNTPMix、10×BstDNA聚合酶缓冲液及1...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐勇军，邬燕琪，
申请(专利权)人：深圳市埃克特生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44