用于检测血清型产气肠杆菌分型的悬液芯片及应用制造技术

本发明专利技术提供了用于检测产气肠杆菌血清型1‑8型的特异寡核苷酸序列，该寡核苷酸包括：（1）产气肠杆菌1型、2型、3型、5型、6型、7型和8型的

Suspension chip for detecting serotype of Enterobacter parenteriae and its application

The present invention provides for the detection of Enterobacter aerogenes serotype 1 type 8 specific oligonucleotide sequences of the oligonucleotides, including: (1) Enterobacter aerogenes type 1, type 2, type 3, type 5, type 6, type 7 and type 8

【技术实现步骤摘要】
用于检测血清型产气肠杆菌分型的悬液芯片及应用
本专利技术属于细菌检测方法
，涉及用于我国常见血清型产气肠杆菌分型的悬液芯片及应用。
技术介绍
血清学分型自上世纪30年代开始被广泛使用，至今已有超过80年的历史，可在种/属内将细菌进一步分类，是一种重要的细菌鉴定方法，目前，血清学鉴定方法是使用最为普遍的致病菌鉴定和溯源方法。例如：我国针对志贺氏菌（GB/T4789.5-2012）、致泻性大肠肝菌（GB/T4789.6-2003）、大肠肝菌O157：H7（GB/T4789.36-2008）、副溶血狐菌（GB/T4789.7-2013）、沙门氏菌（GB/T4789.4-2010）和小肠结肠耶尔森菌（GB/T4789.8-2008）等致病菌检验的国家标准中均采用了血清学鉴定的方法。血清学鉴定主要是基于细菌表面多糖抗原和鞭毛抗原的免疫原性进行。表面抗原位于细菌最外层，长期受到宿主免疫系统和其它环境因素的强大选择压力，而细菌表面抗原在这一压力下形成的高度多样性也为细菌的血清学分型提供了重要基础。传统血清学鉴定方法虽被广泛使用，但仍存在诸多缺陷。主要包括：1）建立血清学分型系统的工作繁琐、周期长，例如：建立一个较为全面的大肠杆菌血清学分型系统经历了30余年的时间（约1944-1977)；因此，一些重要致病菌的血清学分型系统尚未建立，给这些致病菌的鉴定、监测和溯源工作带来了巨大困难；2）抗血清的生产和质控较为困难，为了避免交叉反应，抗血清生产中需进行大量吸附反应；3）很多抗血清国际上只有少数几家单位生产和保存，且用于鉴定的抗血清严重不全，国际上生产细菌抗血清的主要公司美国的Difco公司、日本的DenkaSeiken公司、泰国S&A公司等提供不到实际需要种类的20%；4）血清学鉴定的实验过程耗时较长，以沙门氏菌为例，自获得纯培养物至完成血清型鉴定需要2-6天。上述缺陷严重限制了致病菌早期诊断的效率，为传染病的流行和暴发埋下了隐患。建立与传统血清学方法相对应的高通量分子甄别技术，不但可大幅度提高细菌血清型鉴定的速度、准确性和通量，而且可使基于传统血清学鉴定和分子生物学鉴定的各种流行病学数据之间能够有效整合、协调，并可让使用不同细菌鉴定技术的实验室之间能够进行数据交流，从而有利于传染病多层次防控体系的建立。悬液芯片是芯片技术与流式细胞术相结合的新技术。即将DNA、抗体等附着于微球表面作为探针，在悬液中与待测物结合，再加入荧光标记的报道分子，借助流式细胞仪检测微球表面荧光标记物。除了具有高通量、特异性高和灵敏度高等特点外，与传统的固相芯片比较，其还具有信号收集和处理快速、操作简便、成本相对低廉等特点。近年来，随着悬液芯片技术的逐渐成熟，其正逐步用于科研和多个分子生物学诊断实验室，并逐渐商业化，显示了较好的应用前景。细菌表面多糖抗原在细菌和外部环境的相互作用中扮演着非常重要角色。特别是他们常常是免疫系统对入侵的致病菌的首要识别及攻击目标，同时也在致病性细菌黏附，侵染宿主细胞以及躲避宿主细胞的免疫攻击的过程中起着重要的作用。细菌表面多糖抗原的多样性是构成细菌血清学分类的基础。参与细菌表面多糖抗原合成的基因一般以基因簇的形式存在于染色体上一个特定位点。上述多糖抗原基因簇中，其内部基因按照行使功能的不同可分为3类：单糖合成酶基因，糖基转移酶基因和寡糖单位处理酶基因。1998年，Wang和Reeves提出了O抗原基因簇中的寡糖单位处理酶基因（wzx和wzy）最具血清型特异性的这一理论，对于细菌的可靠的分子分型体系的建立具有重要意义。产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)能引起机会感染和医院内感染，可在患者的呼吸道、泌尿生殖道、脓液和血液等标本中检出，是肠杆菌科肠杆菌属中最常见的临床分离菌之一。近年来，产气肠杆菌的分离率明显增多，特别是在ICU、烧伤科、呼吸内科、泌尿外科等，表明其广泛存在于病区环境，已成为医院感染的重要致病菌之一。且由于该菌耐药性较强，给临床抗感染治疗带来困难。与其他一些重要致病菌，例如大肠杆菌、沙门氏菌、副溶血弧菌等不同，目前，关于产气肠杆菌的血清学分型体系还未见报道。在前期研究中，我们收集了54株国内不同来源的产气肠杆菌临床分离株。运用第二代Illumina/Solexa基因组分析仪的进行测序，并通过比较基因组学和生物信息学技术，定位了该菌表面多糖抗原基因簇在基因组上的位置，鉴定了8种多糖抗原基因簇类型，即8种不同血清型的产气肠杆菌。
技术实现思路
本专利技术提供了用于检测产气肠杆菌血清型1-8型的特异寡核苷酸序列，结合Bio-Rad公司的Bio-Plex200悬液芯片系统，建立了一套用于检测产气肠杆菌血清型1-8型的悬液芯片检测系统及其检测方法，填补了关于产气肠杆菌的血清学分型技术的空白，对于产气肠杆菌的临床检测和流行病学监测具有重要意义。为实现上述目的，本专利技术公开了如下的
技术实现思路
：连接在标记有不同荧光染料磁性微球上的寡核苷酸探针，其特征在于该寡核苷酸包括下述DNA片段：（1）产气肠杆菌1型、2型、3型、5型、6型、7型和8型的wzy基因中选取的一种DNA片段；（2）产气肠杆菌4型的orf8基因中选取的一种DNA片段；上述的寡核苷酸DNA片段为SEQIDNO:1-8所示的核苷酸序列如下：SEQID(5'-3')NO:1GATGGCTTCAAATCAAGTAGT用于检测产气肠杆菌1型NO:2AGCACTATACATACCGATTAAA用于检测产气肠杆菌2型NO:3GCTATTACCAAATGCGAGTAG用于检测产气肠杆菌3型NO:4ACTGGGATACATGGTTGCG用于检测产气肠杆菌4型NO:5ATACGCAGCATTTAAGAGAGA用于检测产气肠杆菌5型NO:6AAGGTTCAGTTGGGTTACGC用于检测产气肠杆菌6型NO:7ACCAGGTTTGGCAAGACA用于检测产气肠杆菌7型NO:8TTTCGTGGGACAAACGTAGA用于检测产气肠杆菌8型。本专利技术进一步公开了所述连接在标记有不同荧光染料磁性微球上的寡核苷酸探针在制备用于检测产气肠杆菌1-8型中至少一种血清型的悬液芯片方面的应用。检测的实验结果显示该悬液芯片可以完成产气肠杆菌1-8型中至少一种血清型的检测。本专利技术更进一步公开了连接在标记有不同荧光染料磁性微球上的寡核苷酸探针悬液芯片的制备方法，主要包含以下步骤：（1）在产气肠杆菌1-3型和5-8型的wzy基因内部，以及产气肠杆菌4型的orf8基因内部设计并制备用于多重PCR的DNA引物，每个血清型的引物包含上、下游引物个1对，且下游引物利用生物素基团进行标记；（2）在产气肠杆菌1-3型和5-8型的wzy基因内部，以及产气肠杆菌4型的orf8基因内部设计并制备用DNA探针，每个血清型的探针在基因上的位置均位于对应的上、下游引物之间，每条DNA探针在5'末端均加入15个胸腺嘧啶核苷酸（dT）作为连接臂，并在连接臂末端加入氨基基团进行修饰，以便与带有羟基基团的磁性微球进行偶联；（3）利用步骤（2）特异探针与不同荧光染料磁性微球上的寡核苷酸探针微球的偶联；（4）制备待检测样品的基因组DNA，利用步骤（1）制备的引物，进行多重PCR扩增；（5）利用步骤（4）获得扩增本文档来自技高网...

【技术保护点】
连接在标记有不同荧光染料磁性微球上的寡核苷酸探针，其特征在于该寡核苷酸包括下述DNA片段：（1）产气肠杆菌1型、2型、3型、5型、6型、7型和8型的

【技术特征摘要】
1.连接在标记有不同荧光染料磁性微球上的寡核苷酸探针，其特征在于该寡核苷酸包括下述DNA片段：（1）产气肠杆菌1型、2型、3型、5型、6型、7型和8型的wzy基因中选取的一种DNA片段；（2）产气肠杆菌4型的orf8基因中选取的一种DNA片段；上述的寡核苷酸DNA片段为SEQIDNO:1-8所示的核苷酸序列如下：SEQID(5'-3')NO:1GATGGCTTCAAATCAAGTAGT用于检测产气肠杆菌1型NO:2AGCACTATACATACCGATTAAA用于检测产气肠杆菌2型NO:3GCTATTACCAAATGCGAGTAG用于检测产气肠杆菌3型NO:4ACTGGGATACATGGTTGCG用于检测产气肠杆菌4型NO:5ATACGCAGCATTTAAGAGAGA用于检测产气肠杆菌5型NO:6AAGGTTCAGTTGGGTTACGC用于检测产气肠杆菌6型NO:7ACCAGGTTTGGCAAGACA用于检测产气肠杆菌7型NO:8TTTCGTGGGACAAACGTAGA用于检测产气肠杆菌8型。2.权利要求1所述连接在标记有不同荧光染料磁性微球上的寡核苷酸探针在制备用于检测产气肠杆菌1-8型中至少一种血清型的悬液芯片方面的应用。3.权利要求1所述连接在标记有不同荧光染料磁性微球上的寡核苷酸探针悬液芯片的制备方法，主要包含以下步骤：（1）在产气肠杆菌1-3型和5-8型的wzy基因内部，以及产气肠杆菌4型的orf8基因内部设计并制备用于多重PCR的DNA引物，每个血清型的引物包含上、下游引物个1对，且下游引物利用生物素基团进行标记；（2）在产气肠杆菌1-3型和5-8型的wzy基因内部，以及产气肠杆菌4型的orf8基因内部设计并制备用DNA探针，每个血清型的探针在基因上的位置均位于对应的上、下游引物之间，每条DNA探针在5'末端均加入15个胸腺嘧啶核苷酸（dT）作为连接臂，并在连接臂末端加入氨基基团进行修饰，以便与带有羟基基团的磁性微球进行偶联；（3）利用步骤（2）制备的特异探针与标记有不同荧光染料的磁性微球进行偶联；（4）制备待检测样品的基因组DNA，利用步骤（1）制备的引物，进行多重PCR扩增；（5）利用步骤（4）获得扩增产物与步骤（3）获得的偶联微球的探...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭玺，刘斌，汪露，武潘，张媛媛，
申请(专利权)人：南开大学，
类型：发明
国别省市：天津,12