褐飞虱沃尔巴克氏体的检测引物、试剂盒和检测方法技术

本发明专利技术公开了一种褐飞虱沃尔巴克氏体的检测引物及其检测方法和检测试剂盒。褐飞虱沃尔巴克氏体的检测引物，wLugF：5’‑GGCTGATAATCCAGCAATTGC‑3’；wLugR：5’‑AAAAATTAAACGCTACTCCA‑3’。利用本发明专利技术的检测引物按照本发明专利技术的检测方法能够快速高效专一的检测出褐飞虱沃尔巴克氏体，具有专一性强，特异性高(只检测出褐飞虱沃尔巴克氏体，而灰飞虱沃尔巴克氏体不发生扩增)，灵敏度高，其最低检测限为30×10

【技术实现步骤摘要】
褐飞虱沃尔巴克氏体的检测引物、试剂盒和检测方法
本专利技术属于分子生物学领域，具体涉及一种褐飞虱沃尔巴克氏体的检测引物及其检测方法和检测试剂盒。
技术介绍
沃尔巴克氏体作为一种母系遗传的专性胞内共生菌，广泛存在于大量的节肢动物体内。已有的研究表明，在全世界范围内，理论上约有60％的昆虫感染了沃尔巴克氏体。沃尔巴克氏体不仅可以在寄主体内诱导胞质不亲和(CytoplasmicIncompatibility，CI)表型达到种群压制效果，同时也能通过其所推动的种群替换达到阻断虫媒病毒的作用。CI是指当感染一种沃尔巴克氏体的雄虫与不感染沃尔巴克氏体的雌虫或感染不同株系沃尔巴克氏体的雌虫交配时所产后代胚胎的死亡，从而表现为成虫的不育。在防治目标区域内，持续地释放经人工转染的沃尔巴克氏体所修饰而具有诱导CI能力的白纹伊蚊Aedesalbopictus雄虫与野外的雌虫交配，可以达到快速压制野生种群效果。与此同时，与传统农药相比，基于沃尔巴克氏体的防治策略具有靶标专一性的优势，大大减少了对生态系统中其他生物群落的影响，对环境的破坏程度也大大降低。通过人工转染的方式，将这样一种垂直传播的共生菌水平地从原始寄主转入一个新寄主体内，并使其稳定遗传下去，从而建立一个新的感染品系，作为防治其野生种群的供体的过程，是沃尔巴克氏体应用研究中最为关键的一部分。大量的研究表明，在实验室条件下利用显微注射技术能够成功地实现沃尔巴克氏体在不同寄主之间的水平转染。一旦进入新的寄主，Wolbachia往往可以不同程度地影响寄主的表型，比如表达CI、提高寄主的抗病毒能力以及缩短寄主寿命等等。已经有研究表明综合利用沃尔巴克氏体所诱导的表型，可以成功通过种群替换的方式阻断登革病毒的传播。稻飞虱作为一种重要的农业害虫，对我国首要的粮食作物——水稻的生产造成了极大的危害。除了造成水稻的减产甚至部分田块的绝收，每年由于对其防治造成的经济损失也十分惊人。其中，褐飞虱Nilaparvatalugens作为一种单食性(仅取食水稻和野生稻)长距离迁飞害虫，凭借其刺吸、产卵以及传毒等为害方式，每年都可以在我国造成百万吨计的产量损失。考虑到化学杀虫剂的长期使用带来的抗性会无法避免地降低其对稻飞虱的防治效果，新的防治手段的研究与开发一直是科学家们所关注的热点问题，也符合有害昆虫综合治理(IPM)的总体方针。我国危害水稻的稻飞虱主要有三种：褐飞虱和灰飞虱和白背飞虱三种，其中以褐飞虱发生和为害最重。目前针对飞虱沃尔巴克氏体的检测是通过PCR来完成的。而且只能检测出飞虱通用类型的沃尔巴克氏体，由于不同飞虱携带不同类型的沃尔巴克氏体，所以找到特异性的检测引物和检测方法显得尤为重要。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一种专一性强、特异性高和灵敏度高的褐飞虱沃尔巴克氏体的检测引物。实现上述目的的技术方案如下。本专利技术的褐飞虱沃尔巴克氏体的检测引物，其上游引物和下游引物分别如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示。本专利技术的另一目的是提供一种褐飞虱沃尔巴克氏体的检测方法。实现该目的的技术方案如下。一种褐飞虱沃尔巴克氏体的检测方法，包括以下步骤：(1)先把褐飞虱在无水酒精里浸泡，提取样品DNA；(2)加入样品DNA稀释10倍为模板，以SEQIDNO.1和SEQIDNO.2作为PCR引物，进行PCR扩增。优选地，扩增时加入的样品DNA的浓度为是50×10-1-30×10-4ng/μl。所述的进行PCR扩增，其反应条件优选为：94℃预变性5分钟；95℃变性5秒、55℃退火30秒、72℃延伸30秒，30个循环；72℃最后延伸5分钟。本专利技术的另一目的是提供一种褐飞虱沃尔巴克氏体的检测试剂盒。一种褐飞虱沃尔巴克氏体的检测试剂盒，包括检测引物和PCR试剂，所述的检测引物为：wLugF：5’-GGCTGATAATCCAGCAATTGC-3’；wLugR：5’-AAAAATTAAACGCTACTCCA-3’。优选地，还包括有褐飞虱的DNA提取试剂，DNA提取试剂包括有稀释缓冲液和DNARelease。优选地，所述稀释缓冲液为：30mMNaOH、0.25mMEDTA、15mMTris-HCl，溶剂为水；每20μl稀释缓冲液中加入0.5μlDNARelease。本专利技术的另一目的是提供一种褐飞虱沃尔巴克氏体DNA的提取方法。一种褐飞虱沃尔巴克氏体DNA的提取方法，包括以下步骤：先把褐飞虱在无水酒精里浸泡2±0.2分钟，然后把褐飞虱放入稀释缓冲液和DNARelease中；瞬时离心后，放入PCR仪中进行DNA提取；DNA提取程序：55℃，5min；98℃，5min；30℃，10s，即得。由于褐飞虱整虫比灰飞虱大很多，脂肪和蛋白质含量较多，普通的磁珠法提取出的DNA，不能有效的去除这些脂肪和蛋白质，会导致PCR扩增结果不稳定，有些褐飞虱体内的沃尔巴克氏体扩增不出来条带；而使用本专利技术的DNA提取液，因含有专门的DNArelease，可以有效的去除多余的脂肪和蛋白质，提取出褐飞虱体内的DNA，利于后续的PCR扩增。通过图6，很明显的看出用本专利技术的DNA提取液，扩增准确性和扩增效率都很高。利用本专利技术的检测引物按照本专利技术的检测方法能够快速高效专一的检测出褐飞虱沃尔巴克氏体，具有专一性强，特异性高(只检测出褐飞虱沃尔巴克氏体，而灰飞虱沃尔巴克氏体不发生扩增)，灵敏度高，其最低检测限为30×10-4ng/μl。因此，本专利技术所述褐飞虱沃尔巴克氏体的检测引物和试剂盒具有快速高效、操作简便、高特异性、高灵敏度、鉴定简便等优点。附图说明图1是实施例2中特异性实验结果，其中M为Marker，1-3为广州褐飞虱的沃尔巴克氏体，4-6为广州灰飞虱的沃尔巴克氏体。图2，图3，图4是实施例3中灵敏度实验结果，其中M为Marker，1为稀释10倍的DNA样品，2、3、4、5、6分别是10、100、1000、10000、100000、1000000倍稀释的DNA样品。图5是实施例4中引物对比实验结果，其中M为Marker，1-6为通用引物，其中1-3为褐飞虱基因组DNA，4-6为灰飞虱基因组DNA；7-12为本专利技术所述的褐飞虱特异性引物(SEQIDNO.1和SEQIDNO.2)，其中7-9为褐飞虱基因组DNA，10-12为灰飞虱基因组DNA。图6是实施例5中的实验结果示意图，1-5是普通DNA提取液提取的DNA进行扩增的结果，6-10是本专利技术DNA提取液提取的DNA进行扩增的结果。具体实施方式为了便于理解本专利技术，下面将对本专利技术进行更全面的描述。本专利技术可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本专利技术的公开内容的理解更加透彻全面。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork：ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。除非另有定义，本专利技术所使用的所有的技术和科学术语与属于本专利技术的
的技术人员通常理解的含义相同。本专利技术的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本专利技术。本专利技术所使本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种褐飞虱沃尔巴克氏体的检测引物，其特征在于，其上游引物和下游引物分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

【技术特征摘要】
1.一种褐飞虱沃尔巴克氏体的检测引物，其特征在于，其上游引物和下游引物分别如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示。2.一种褐飞虱沃尔巴克氏体的检测试剂盒，其特征在于，包括检测引物和PCR试剂，所述的检测引物如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示。3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，还包括有褐飞虱的DNA提取试剂，该DNA提取试剂包括有稀释缓冲液和DNARelease。4.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述稀释缓冲液为：30mMNaOH、0.25mMEDTA、15mMTris-HCl，溶剂为水；每20μl稀释缓冲液中加入0.5μlDNARelease。5.一种褐飞虱沃尔巴克氏体的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)先把褐飞虱在无水酒精里浸泡，提取样品DNA；(2)加入样品DNA稀释10倍为模板，以SEQIDNO.1和SEQIDNO.2作为PCR引物，进行PCR扩增。6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述的进行PCR扩增，其反应条件为：94℃预变性...

【专利技术属性】
技术研发人员：不公告发明人，
申请(专利权)人：广州威佰昆生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44