同时检测黄化病植原体、溃疡病病原菌和叶斑病病原菌的核酸、试剂盒及方法技术

本发明专利技术涉及一组用于同时检测黄化病植原体、溃疡病病原菌和叶斑病病原菌的三种病原的核酸、试剂盒和检测方法，其中，用于多重PCR同时检测三种病原的核酸包括黄化病植原体、溃疡病病原菌和叶斑病病原菌的三种病原的上、下游引物；用于荧光定量PCR同时检测三种病原的核酸还包括有各病原对应的探针。本发明专利技术还建立了一种比较高效、灵敏的，可同时检测黄化病植原体、溃疡病病原菌和叶斑病病原菌这三种病原的检测方法。该方法能有效提高检测的灵敏度，避免假阴性结果的发生，为能有效预防黄化病、溃疡病和叶斑病提供一种技术手段。

Simultaneous detection of nucleic acids, kits and methods for the pathogens of phytoplasma, ulcerative pathogens and leaf spot of yellowing disease

The invention relates to a group for simultaneous detection of three pathogenic yellows phytoplasma, canker pathogens and pathogen causing leaf spot disease of nucleic acid, reagent kit and detection method, which, for the simultaneous detection of three kinds of pathogenic nucleic acid including three pathogenic yellows phytoplasma, canker pathogens and pathogen causing leaf spot disease the upstream and downstream primers for multiplex PCR; fluorescence quantitative PCR detection of nucleic acids and three kinds of pathogens including the corresponding pathogen. The invention also establishes a highly effective and sensitive method for simultaneous detection of three etiological agents, namely etiolated phytoplasma, ulcer pathogen and leaf spot pathogen. This method can effectively improve the sensitivity of detection, avoid the occurrence of false negative results, and provide a technical means for effective prevention of yellows, ulcers and leaf spot.

【技术实现步骤摘要】
同时检测黄化病植原体、溃疡病病原菌和叶斑病病原菌的核酸、试剂盒及方法
本专利技术属于生物检测技术，具体涉及一种用于同时检测黄化病植原体、溃疡病病原菌和叶斑病病原菌的核酸、试剂盒及方法。
技术介绍
植原体(Phytoplasma)是引起植物病害的一类重要病原，其侵染性强，危害寄主广泛，曾造成许多重要的粮食、蔬菜、花卉、中药和果树作物以及观赏作物、林木树种和林荫树的大量死亡，造成严重的经济损失柳树黄化病是由柳树黄化植原体(WillowYellowPhytoplasma，WY)引起的病害，由过去的零星发病逐渐蔓延开来，近年来在华北、西北地区成片发生，感病初期被害叶轻度失绿变黄，但叶脉保持正常绿色，且一般由个别叶片失绿变黄，逐步蔓延到整个树冠,感病后期叶片变薄,枯萎缩小，枝条干枯，受害树逐渐枯死，造成了巨大的经济损失。因此，对柳树黄化病的研究是生产中长期亟待解决的问题。植原体的检测方法有组织化学技术检测法和血清学方法，组织化学技术检测法是充分利用光学显微镜检查植物和介体昆虫体内植原体存在的有效手段，不是对植原体特异染色,只是对植原体的间接检测,容易造成假阳性。该方法与电子显微镜观察一样,在检测中都是结合症状特征,寄主范围以及抗生素实验进行的,费时费力,灵敏度低,而且只能证明待检植株是否感染植原体,无法区分不同的植原体,这些缺点限制了该类方法的应用,已经越来越不能满足现代生产的需要。血清学方法是利用抗原抗体反应对植原体进行检测,已建立的诊断技术有琼脂双扩散、酶联免疫吸附法(ELISA)、斑点酶联免疫法(Dot-ELISA)、免疫荧光染色及免疫电镜技术等。虽然血清学分析技术比电镜检测技术更具特异性和灵敏性，但多数多克隆抗体却与健康植物寄主抗原存在强烈的交叉反应，导致检测结果不准确。柳树是中国的原生树种，也是我国被记述的人工栽培最早、分布范围最广的植物之一，柳树易繁殖，栽培方法简单，生命力强，可美化环境，在生活、环保、医药等方面也有用途，是“四旁”绿化树种。近年来，柳树的溃疡病、叶斑病和黄化病的发病率不断上升，而且三者复合侵染的情况越来越多，给种植的农户造成重大损失。目前尚缺乏柳树的黄化病、溃疡病和叶斑病的高效杀菌剂和抗病品种，一旦发现有感染这几种病害，需要及时清除病树，防止病害蔓延此外，还要加强非疫区的管理，防止这几种病害的侵入，因此，针对柳树的黄化病植原体、溃疡病病原菌和叶斑病病原菌建立早期快速定量检测方法就显得尤为重要。
技术实现思路
(一)要解决的技术问题为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种用于多重PCR同时检测黄化病植原体、溃疡病病原菌和叶斑病病原菌的核酸，还提供了采用多重实时荧光定量PCR检测黄化病植原体、溃疡病病原菌和叶斑病病原菌的核酸、试剂盒及其检测方法。(二)技术方案为了达到上述目的，本专利技术采用的主要技术方案包括：一组用于多重PCR同时检测三种病原的核酸，其包括用于检测黄化病植原体、溃疡病病原菌和叶斑病病原菌的上、下游引物，其中，所述黄化病植原体的上游引物序列如SEQIDNo.1所示，下游引物序列如SEQIDNo.2所示；所述溃疡病病原菌的上游引物序列如SEQIDNo.4所示，下游引物序列如SEQIDNo.5所示；所述叶斑病病原菌的上游引物序列如SEQIDNo.7所示，下游引物序列如SEQIDNo.8所示。一组用于荧光定量PCR同时检测三种病原的核酸，其包括如上所述的黄化病植原体、溃疡病病原菌和叶斑病病原菌的三种病原上、下游引物及各病原体对应的探针，其中，所述黄化病植原体的探针序列如SEQIDNo.3所示；所述溃疡病病原菌的探针序列如SEQIDNo.6所示；所述叶斑病病原菌的探针序列如SEQIDNo.9所示。如上所述的核酸，优选地，该组核酸还包括包含检测黄化病植原体、溃疡病病原菌和叶斑病病原菌的阳性扩增产物，其中，所述检测黄化病植原体的阳性扩增产物，包含如SEQIDNo.10所示的序列；所述检测溃疡病病原菌的阳性扩增产物，包含如SEQIDNo.11所示的序列；所述检测叶斑病病原菌的阳性扩增产物，包含如SEQIDNo.12所示的序列。一种用于荧光定量PCR同时检测三种病原的试剂盒，该试剂盒包括：如权利要求2所述的黄化病植原体、溃疡病病原菌和叶斑病病原菌的三种病原的上、下游引物和相应的探针，各条探针的5'端和3'端分别对应标记TEXRED-BHQ2、FAM-TAMRA和CY5-BHQ3。如上所述的试剂盒，优选地，还包括检测黄化病植原体、溃疡病病原菌和叶斑病病原菌的阳性扩增产物，其中，所述检测黄化病植原体的阳性扩增产物，含如SEQIDNo.10所示的序列；所述检测溃疡病病原菌的阳性扩增产物，含如SEQIDNo.11所示的序列；所述检测叶斑病病原菌的阳性扩增产物，含如SEQIDNo.12所示的序列。如上所述的试剂盒，优选地，还包括PremixEXTaqTM×2。一种用于荧光定量PCR同时检测三种病原的检测方法，该方法用于检测黄化病植原体、溃疡病病原菌和叶斑病病原菌的三种病原，具体包括以下步骤：(1)从样品中提取DNA；(2)对提取的所述DNA进行荧光定量PCR扩增；其中，荧光定量PCR扩增时，在反应体系中，采用所述黄化病植原体的上、下游引物和探针的核苷酸序列如SEQIDNo.1、SEQIDNo.2和SEQIDNo.3所示，其探针5'端和3'端分别对应标记TEXRED和BHQ2；所述溃疡病病原菌的上、下游引物和探针的核苷酸序列如SEQIDNo.4SEQIDNo.4、SEQIDNo.5和SEQIDNo.6所示，其探针5'端和3'端分别对应标记FAM和TAMRA；所述叶斑病病原菌的上、下游引物和探针的核苷酸序列如SEQIDNo.7、SEQIDNo.8和SEQIDNo.9所示，其探针5'端和3'端分别对应标记CY5和BHQ3；(3)收集荧光信号，选择步骤(2)中的荧光基团的荧光检测模式，基线调整取3～15个循环的荧光信号，以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；(4)结果判定：待测样品荧光增长曲线超过阈值线，并呈现良好的对数增长，则判断为阳性，如无典型的扩增曲线，判断为阴性。如上所述的检测方法，优选地，所述步骤(2)中荧光定量PCR扩增的反应体系具体如下：1×PremixEXTaqTM，所述黄化病植原体上游引物、下游引物的终浓度为0.32μmol/L，探针的终浓度为0.24μmol/L；所述溃疡病病原菌上游引物、下游引物的终浓度为0.32μmol/L，探针的终浓度为0.32μmol/L；所述叶斑病病原菌上游引物、下游引物终浓度为0.4μmol/L，探针的终浓度为0.48μmol/L；所述样品的DNA为1μL；同时设置无核酸酶水为阴性对照；同时分别设置包含如SEQIDNo.10所示的序列、SEQIDNo.11所示的序列、SEQIDNo.12所示的序列的基因作为阳性对照。如上所述的检测方法，优选地，所述步骤(2)中荧光定量PCR扩增的反应程序为：预变性阶段95℃，5min；扩增阶段95℃，15sec；59℃，30sec；72℃，35sec，45个循环；72℃，7min；4℃保温。如上所述的检测方法，优选地，所述步骤(4)结果判定中，所述阈值为35，当Ct值≤35时，有明显扩增曲线为阳性结果；Ct值＞40本文档来自技高网...

【技术保护点】
一组用于多重PCR同时检测三种病原的核酸，其特征在于，包括用于检测分别黄化病植原体、溃疡病病原菌和叶斑病病原菌的上、下游引物，其中，所述黄化病植原体的上游引物序列如SEQ ID No.1所示，下游引物序列如SEQ ID No.2所示；所述溃疡病病原菌的上游引物序列如SEQ ID No.4所示，下游引物序列如SEQ ID No.5所示；所述叶斑病病原菌的上游引物序列如SEQ ID No.7所示，下游引物序列如SEQ ID No.8所示。

【技术特征摘要】
1.一组用于多重PCR同时检测三种病原的核酸，其特征在于，包括用于检测分别黄化病植原体、溃疡病病原菌和叶斑病病原菌的上、下游引物，其中，所述黄化病植原体的上游引物序列如SEQIDNo.1所示，下游引物序列如SEQIDNo.2所示；所述溃疡病病原菌的上游引物序列如SEQIDNo.4所示，下游引物序列如SEQIDNo.5所示；所述叶斑病病原菌的上游引物序列如SEQIDNo.7所示，下游引物序列如SEQIDNo.8所示。2.一组用于荧光定量PCR同时检测三种病原的核酸，其特征在于，包括如权利要求1所述的用于检测黄化病植原体、溃疡病病原菌和叶斑病病原菌的上、下游引物及各病原体对应的探针，所述黄化病植原体的探针序列如SEQIDNo.3所示；所述溃疡病病原菌的探针序列如SEQIDNo.6所示；所述叶斑病病原菌的探针序列如SEQIDNo.9所示。3.如权利要求1或2所述的核酸，其特征在于，该组核酸还包括包含检测黄化病植原体、溃疡病病原菌和叶斑病病原菌的阳性扩增产物，其中，所述检测黄化病植原体的阳性扩增产物，包含如SEQIDNo.10所示的序列；所述检测溃疡病病原菌的阳性扩增产物，包含如SEQIDNo.11所示的序列；所述检测叶斑病病原菌的阳性扩增产物，包含如SEQIDNo.12所示的序列。4.一种用于荧光定量PCR同时检测三种病原的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：如权利要求2所述的黄化病植原体、溃疡病病原菌和叶斑病病原菌的三种病原的上、下游引物和相应的探针，各条探针的5'端和3'端分别标记TEXRED-BHQ2、FAM-TAMRA和CY5-BHQ3。5.如权利要求4所述的试剂盒，优选地，还包括检测黄化病植原体、溃疡病病原菌和叶斑病病原菌的三种病原的阳性扩增产物，其中，所述检测黄化病植原体的阳性扩增产物，含如SEQIDNo.10所示的序列；所述检测溃疡病病原菌的阳性扩增产物，含如SEQIDNo.11所示的序列；所述检测叶斑病病原菌的阳性扩增产物，含如SEQIDNo.12所示的序列。6.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包括PremixEXTaqTM×2。7.一种用于荧光定量PCR同时检测三种病原的检测方法，其特征在于，该方法用于检测黄化病植原体、溃疡病病原菌和叶斑病病原菌的三种病原，具体包...

【专利技术属性】
技术研发人员：李伟，张翠萍，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：山东,37